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Artigo de método

Isolamento de células de gânglio retiniano murino primário (RGCs) por citometria de fluxo

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DOI:

10.3791/55785

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5 de julho de 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Hamilton Eye Institute, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Microbiology, Immunology and Biochemistry, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmaceutical Sciences, University of Tennessee Health Science Center

Neste artigo

Resumo

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Resumo

As doenças neurodegenerativas muitas vezes têm um impacto devastador sobre os afetados. A perda de células ganglionares retinianas (RGC) está implicada em uma série de doenças, incluindo retinopatia diabética e glaucoma, além do envelhecimento normal. Apesar da sua importância, os RGCs têm sido extremamente difíceis de estudar até agora devido em parte ao fato de que eles compreendem apenas uma pequena porcentagem da grande variedade de células na retina. Além disso, os métodos de isolamento atuais usam marcadores intracelulares para identificar RGCs, que produzem células não viáveis. Essas técnicas também envolvem longos protocolos de isolamento, portanto, há uma falta de métodos práticos, padronizados e confiáveis ​​para obter e isolar RGCs. Este trabalho descreve um método eficiente, abrangente e confiável para isolar RGC primários de retinae de camundongos usando um protocolo baseado em critérios de seleção positivos e negativos. Os métodos apresentados permitem o estudo futuro de RGCs, com o objetivo de melhor compreender o maiorDeclínio na acuidade visual que resulta da perda de RGCs funcionais em doenças neurodegenerativas.

Introdução

Os RGCs são neurônios terminalmente diferenciados e, portanto, células primárias são necessárias para a experimentação. O desenvolvimento de um protocolo para isolamento e enriquecimento de células de gânglios retinianos murinos primários (RGCs) é fundamental para revelar os mecanismos de saúde e degeneração de RGC in vitro . Isto é especialmente importante para estudos que buscam gerar terapias potenciais para promover a função RGC e para minimizar sua morte. A degeneração de RGCs está associada a doenças degenerativas da retina, como glaucoma, retinopatia diabética e envelhecimento normal. Embora os mecanismos celulares específicos subjacentes à perda de R....

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Protocolo

Todos os procedimentos detalhados no seguinte protocolo foram aprovados pelo conselho de avaliação institucional do Comité de Consumo e Uso Animal (IACUC) do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Tennessee (UTHSC) e seguiram a Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declarações para o Uso De Pesquisa de Animais em Oftálmica e Visão, além das diretrizes para experimentos em laboratório de animais (Instituto de Recursos de Laboratório de Animais, Política de Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório).

1. Preparação de instrumentos, soluções e mídia

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Resultados

O estudo aprofundado de RGCs é impedido por muitos fatores, incluindo sua baixa freqüência e a falta de uma metodologia robusta e padronizada para seu isolamento. A Figura 1 mostra a metodologia utilizada para isolamento de retina. As variações no procedimento de enucleação existem com base no tipo de análise, como se a enucleação faz parte da experimentação in vivo 27 . A enucleação neste protocolo é realizada em ratin.......

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Discussão

FACS é a técnica de escolha para purificar populações celulares. Outros métodos de isolamento incluem imunopanning, esferas magnéticas e depleção de fixação do complemento. A vantagem do FACS sobre essas outras metodologias baseia-se na identificação simultânea de marcadores de superfície celular com diferentes graus de intensidade. A intensidade fluorescente da molécula é proporcional à quantidade de expressão da proteína. Até agora, o isolamento de RGCs baseava-se unicamente na positividade Thy1 (CD90) e na negativida.......

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Sr. Tim Higgins, Ilustrador Sénior do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Bioquímica, para assistência técnica em vídeo; Dr. Matthew W. Wilson para discussões e os membros dos laboratórios Jablonski e Morales-Tirado por seus comentários úteis. Este trabalho foi apoiado pelo Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), a Fundação de Pesquisa da Universidade do Tennessee (VMM-T), o National Eye Institute EY021200 (MMJ), o Gerwin Fellowship (VMM-T); A Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), o Departamento de Defesa Army Medical Research and Materiel Command (VMM-T), e a concessão irrestrita da pesquisa para prevenir a cegueira....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anti-rato CD15 PEBioLegend125606Clone MC-480
Anti-rato CD48 PE-Cy7BioLegend103424Clone HM48-1
Anti-rato CD57Sigma AldrichC6680-100TSTClone VC1.1
Anti-rato CD90.2 AF700BioLegend105320Clone 30-H12
Violeta Brilhante 421 Cabra Anti-rato IgGBioLegend405317Clone Poly4053
Anti-mouse Purificado CD16/32BioLegend101302bloco FcgRII/III, Clone 93
Zombie Aqua BioLegend423102Discriminação de células vivas/ células mortas
Soro bovino fetalHycloneSH30071.03
Kit de contas de compensação total de anticorpos AbCThermo Fisher ScientificA10497Multi-espécies Ig
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Adicione soro ao meio antes da cultura.
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049Microscópio de Dissecção de Solução Salina
EstéreoModelo Olympus SZ-PT
Centrífuga SorvallThermo ScientificST 16RToda a centrifugação realizada  na
Placa Base RT – Panela de DissecçãoFisher ScientificSB15233FIMUma placa de cera também pode ser usada
FórcepsAesculap5002-74 ½ polegadas
Iris Scissors, StraightAesculap13605 ½ polegadas
Falcon 15 mL tubos cônicosFisher Scientific352097Tubos
de polipropileno Falcon 50 mL tubos cônicos FisherScientific352098Tubos de polipropileno
BD FACS TubosFisher Scientific352003Tubos de polipropileno
pratos de 40 mmMidSciTP93040Cultura de tecidos tratada
70 μ filtro de nylon mMidSci70ICSestéril
40 μ m filtro de nylonMidSci40ICSestéril
  Seringa BD 10 mL SeringaDescartável 301604Fisher Scientific sem agulha
PilõesMidSciPESTestéril
Frascos WheatonFisher Scientific986734Sem Forro
Agulha BD 30 GFisher Scientific305128Câmara
de Contagem de Vidro Hausser Scientific Bright-LineFisher Scientific0267151BHemocitômetro
Gibco Trypan blue 0.4% SolutionFisher Scientific15250061Viability Dye
Eppendorf tubesFisher Scientific05-402-251.5mL
EVOS Floid Cell ImagingThermo Fisher Scientific447113Fluorescence Imaging com um objetivo de 20X
100% EtanolFisher Scientific04-355-452Usado para fazer 70% de etanol
Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+PipetaRainin 17014282LTS
Pipeta Pipet-Lite LTS L-200XLS+Pipeta Rainin17014391LTS
Pipeta Pipet-Lite LTS L-20XLS+Rainin17014392LTS
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000SRainin17005088Blue Rack Pontas Estéreis
Rack LTS 250 mL - GPS-L250SRainin17005092Green Rack Pontas Estéreis
Rack LTS 20 mL - GPS-L10SRainin17005090Pontas Estéreis de Rack Vermelho
FACSAria II Classificador de CélulasBD BiosciencesN/APedido personalizado
LSR II CitômetroBD BiosciencesN/APedido personalizado
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Mü ller cells
Aldh1alThermo Fisher ScientificMm00657317_m1Mü células ller
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1Astrócitos
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1Amacrine, Horizontal
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1Retinal Pigment Epithelial Cells
Gad2Thermo Fisher ScientificMm00484623_m1Amacrine
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1House keeping gene
Lhx1Thermo Fisher ScientificMm01297482_m1Horizontal
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1Horizontal
NrlThermo Fisher ScientificMm00476550_m1Fotorreceptores
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1Horizontal
Pcp4Thermo Fisher ScientificMm00500973_m1Bipolar, Amacrine
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1Células
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1Astrócitos
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1Bipolar
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1Horizontal
PvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1Amacrine
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1Células Ganglionares da Retina
Rom1Thermo Fisher ScientificMm00436364_g1Fotorreceptores
Rpe65Thermo Fisher ScientificMm00504133_m1Células epiteliais do pigmento da retina
Slc1a3Thermo Fisher ScientificMm00600697_m1Astrócitos
Slc6a9Thermo Fisher ScientificMm00433662_m1Amacrine
SncgThermo Fisher ScientificMm00488345_m1Retinal Ganglion
Tubb3Thermo Fisher ScientificMm00727586_s1Retinal Ganglion
VimThermo Fisher ScientificMm01333430_m1Mü ller cells
Taqman Universal Master MixThermo Fisher Scientific4440047qPCR Reagent
miRNeasy Mini KitQiagen217004Isolamento
de RNA SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermo Fisher Scientific11754250cDNA synthesis
Taqman PreAmp Master MixThermo Fisher Scientific4391128Etapa de pré-amplificação
BD Cytofix/ CytopermBD Biosciences554714Fixação/ Tampão de Permeabilização
BD Perm/ WashBD BiosciencesSolução dePermeabilização
RBPMSSanta Cruz Biotechnologysc-86815anticorpo intracelular
SNCGGene TexGTX110483anticorpo intracelular
BRN3ASanta Cruz Biotechnologyanticorpo intracelularSC-8429
TUJ1BioLegend801202anticorpo intracelular
de origem americana Microscópio de 1 polegada PipetaGanglionares da Retina554723

Referências

  1. Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
  2. Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
  3. Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P.

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Reimpressões e permissões

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