Mikrokrystallografi af proteinkrystaller og<em> I Cellulo</em> Diffraktion
Summary
En protokol præsenteres for røntgenkrystallografi ved anvendelse af proteinmikrokrystaller. To eksempler, der analyserer in vivo- dyrkede mikrokrystaller efter rensning eller i cellulose , sammenlignes.
Abstract
Tilstedeværelsen af mikrofokusbjælker af høj kvalitet på mange synkrotronanlæg har muliggjort den rutinemæssige analyse af krystaller mindre end 10 μm i deres største dimension, som plejede at repræsentere en udfordring. Vi præsenterer to alternative arbejdsgange for strukturen bestemmelse af protein mikrokrystaller ved røntgenkrystallografi med et særligt fokus på krystaller dyrket in vivo . Mikrokrystallerne ekstraheres enten fra celler ved sonikering og oprenses ved differentiel centrifugering eller analyseres i cellulose efter celle sortering ved hjælp af flowcytometri af krystalholdige celler. Eventuelt opsuges rensede krystaller eller krystalholdige celler i tunge atomopløsninger til forsøgsfasning. Disse prøver fremstilles derefter til diffraktionsforsøg på lignende måde ved påføring på en mikromesh-understøtning og flash-afkøling i flydende nitrogen. Vi beskriver kort og sammenligner seriediffraktionsforsøg af isolerede mikrokrystaller og krystal-Indeholdende celler ved anvendelse af en mikrofokus-synkrotron-strålelinje til frembringelse af datasæt egnet til fasering, modelbygning og forfining.
Disse arbejdsprocesser er eksemplificeret med krystaller af Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) polyhedrin produceret ved infektion af insektceller med et rekombinant baculovirus. I denne case-undersøgelse er celluloanalyse mere effektiv end analyse af rensede krystaller og giver en struktur i ~ 8 dage fra udtryk til forfining.
Introduction
Anvendelsen af røntgenkrystallografi til bestemmelse af højopløsningsstrukturer af biologiske makromolekyler har oplevet en stabil fremgang i løbet af de sidste to årtier. Den voksende optagelse af røntgenkrystallografi fra ikke-ekspertforskere eksemplificerer demokratisering af denne tilgang på mange områder inden for biovidenskab 1 .
Historisk set har krystaller med dimensioner under ~ 10 μm været betragtet som udfordrende, hvis ikke ubrugelige, til strukturbestemmelse. Den stigende tilgængelighed af dedikerede mikrofokus stråler i synkrotron strålingskilder over hele verden og teknologiske fremskridt, såsom udvikling af værktøjer til at manipulere mikrokrystaller har fjernet mange af disse barrierer, der stymied den brede brug af røntgen mikrokrystallografi. Fremskridt i seriel røntgen-mikrokrystallografi 2 , 3 og mikroelektrondiffraktion 4 haHar vist, at anvendelsen af mikro- og nanokrystaller til strukturbestemmelse ikke kun er mulig, men også nogle gange foretrukket til anvendelse af store krystaller 5 , 6 , 7 .
Disse fremskridt blev først anvendt til undersøgelsen af peptider 8 og naturlige krystaller produceret af insektvirusser 9 , 10 . De anvendes nu til en bred vifte af biologiske makromolekyler, herunder de sværeste systemer, såsom membranproteiner og store komplekser 11 . For at lette analysen af disse mikrokrystaller er de blevet analyseret i meso , især membranproteiner 12 og i mikrofluidiske chips 13 .
Tilgængeligheden af disse nye mikrokrystallografimetoder har øget muligheden for at anvende iVivo-krystallisation som en ny rute for strukturel biologi 14 , 15 , 16, der tilbyder et alternativ til klassisk in vitro- krystallogenese. Desværre, selv når in vivo krystaller kan fremstilles, forbliver der flere forhindringer såsom nedbrydning eller tab af ligander under rensningen fra celler, vanskeligheder med manipulation og visualisering af krystallerne ved synkrotronbundlinjen og kedelige røntgendiffraktionsforsøg. Som en alternativ krystaller er også blevet analyseret direkte i cellen uden noget oprensningstrin 17 , 18 , 19 . En sammenlignende analyse tyder på, at sådanne cellulosefremgangsmåder kan være mere effektive end analysen af rensede krystaller og give data med højere opløsning 20 .
Denne protokol er iTendens til at hjælpe forskere, der er ny til protein mikrokrystallografi. Det giver metoder, der fokuserer på prøveforberedelse og manipulation for røntgendiffraktionseksperimenter ved en synkrotron-strålelinie. To muligheder foreslås ved anvendelse af isolerede krystaller til klassisk mikrokrystallografi eller krystalholdige celler sorteret ved flowcytometri til celluloanalyse ( figur 1 ).
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver to fremgangsmåder til analyse af mikrokrystaller med det formål at lette analysen af meget små krystaller, som man tidligere ville have overset.
Kritiske trin til mikrokrystalrensning
Den præsenterede protokol er blevet optimeret ved anvendelse af Bombyx mori CPV1 polyhedrin udtrykt i Sf9 celler som et modelsystem. Imidlertid viser in vivo mikrokrystaller en stor variation i mekanisk modstand. For eksempel er cathepsin …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne anerkende Chan-Sien Lay for at give billeder af rensede mikrokrystaller, Daniel Eriksson og Tom Caradoc-Davies til understøttelse på Australian Synchrotron MX2-strålen, og Kathryn Flanagan og Andrew Fryga fra FlowCore-anlægget på Monash University for deres Uvurderlig bistand.
Materials
| Sf9 cells | Life Technologies | ||
| SF900-SFM insect medium | Life Technologies | ||
| 1L cell culture flask | Thermofisher Scientific | ||
| Shaking incubator for insect cell culture | Eppendorf | ||
| 50mL conical tubes | Falcon | ||
| Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes | Eppendorf | ||
| Sonicator equiped with a 19mm probe | MSE Soniprep 150 | ||
| Glass slides | Hampton Research | ||
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | ||
| Propidium iodide | Thermofisher Scientific | ||
| BD Influx cell sorter | BD Biosciences | ||
| Hampton Heavy atom screens | Hampton Research | ||
| Microcentrifuge | Eppendorf | ||
| Micromesh | Mitigen | 700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies. | |
| Paper wick | Mitigen | The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used. | |
| Ethylene glycol | Sigma-Aldrich | ||
| Trypan blue | Life Technologies | ||
| MX2 microfocus beamline | Australian Synchrotron | A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793–1806, doi:10.1071/CH14455. |
Referências
- Tari, L. W. The utility of structural biology in drug discovery. Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), (2014).
- Redecke, L., et al. Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser. Science. 339 (2013), 227-230 (2013).
- Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, e01345 (2013).
- Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. Macromolecular microcrystallography. Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).
- Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. Micro-crystallography comes of age. Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).
- Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography. Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).
- Coulibaly, F., et al. The molecular organization of cypovirus polyhedra. Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).
- Coulibaly, F., et al. The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).
- Johansson, L. C., et al. Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography. Nat Comm. 4, (2013).
- Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J Vis Exp. (67), (2012).
- Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Sci Rep. 5, 10451 (2015).
- Koopmann, R., et al. In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology. Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).
- Gallat, F. -. X., et al. In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology. Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).
- Duszenko, M., et al. In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins. Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).
- Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin. Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).
- Sawaya, M. R., et al. Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).
- Tsutsui, H., et al. A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo. Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).
- Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction. Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).
- Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. Protein crystallization in vivo. Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).
- Mori, H., et al. Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra. J Gen Virol. 74, 99-102 (1993).
- Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination. J Vis Exp. (112), (2016).
- Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), (2014).
- Berger, I., et al. The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL. J Vis Exp. (77), (2013).
- Margine, I., Palese, P., Krammer, F. Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System. J Vis Exp. (81), (2013).
- Khurana, A., Kronenberg, M. A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells. J Vis Exp. (10), (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. (16), (2008).
- Baskaran, Y., et al. An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1. Nat Comm. 6, 1-11 (2015).
- Armour, B. L., et al. Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit. J Vis Exp. (76), (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).
- Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM. Acta Cryst D. 67, 271-281 (2011).
- Kabsch, W. XDS. Acta Cryst D. 66, 125-132 (2010).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).
- Foadi, J., et al. Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography. Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).
- Rey, F. A. Virology: holed up in a natural crystal. Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).
- Schönherr, R., et al. Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells. Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).
- Hasegawa, H., et al. In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells. J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).
- Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J Vis Exp. (115), e54463 (2016).
- Zander, U., et al. MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines. Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).
- Fan, G. Y., et al. In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system. Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).
- Nass, K. . Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).
