Summary

成熟シュワン細胞の発生源としての骨髄由来前駆細胞の低酸素プレコンディショニング

Published: June 14, 2017
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Summary

骨髄内には、神経ポテンシャルを有する骨髄間質細胞(MSC)が存在する。我々のプロトコルは、低酸素プレコンディショニングを介してこの細胞集団を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞にするよう指示する。

Abstract

この原稿は、骨髄間質細胞(MSC)集団から神経前駆細胞を濃縮し、その後それらを成熟シュワン細胞運命に導く手段を記載している。我々はラットおよびヒトのMSCに一時的な低酸素状態(16時間酸素1%)を与え、続いて表皮成長因子(EGF)/塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)補充を伴う低付着層上のニューロスフェアとしての拡大を行った。ニューロスフェアをポリ-D-リシン/ラミニン被覆組織培養プラスチック上に播種し、β-ヘレグリン、bFGFおよび血小板由来増殖因子(PDGF)を含有する膠原性カクテルで培養してシュワン細胞様細胞(SCLC)を生成させた。 SCLCは、E14-15妊娠Sprague Dawleyラットから得られた精製背側根神経節(DRG)ニューロンを用いて、共培養によるコミットメントを2週間行った。成熟シュワン細胞は、S100β/ p75発現の持続性を示し、ミエリンセグメントを形成することができる。このようにして生成された細胞は、脊髄損傷後の自己細胞移植における応用、ならびに疾患モデリングに有用である。

Introduction

神経前駆細胞およびそれらの誘導体の移植は、外傷性神経損傷1,2および神経変性3,4の後の治療戦略として有望であることを示している。臨床応用の前に、i)幹/前駆細胞の自己由来源にアクセスして拡大する方法、およびii)それらを関連する成熟細胞型に導く手段を確実にすることが不可欠である3 。脊髄損傷に対する細胞療法への関心は、成体組織からの神経前駆細胞の堅牢な自己由来の細胞供給源を模索するようになった。

MSCの亜集団は、神経堤に由来し、骨髄腔から容易にアクセス可能である。これらの細胞は、ニューロンおよびグリアを生成し得る神経前駆細胞である。脳虚血の動物モデルは、低酸素症がprolを促進することを実証する脳内の神経前駆細胞の発情と多分化能6 。これは、骨髄由来神経前駆細胞を拡張する手段として低酸素プレコンディショニングを利用するための基礎となった。

損傷した脊髄へのシュワン細胞の移植は、再生を促進する2 。 SCLCは、グリオジェニック因子( すなわち、 β-ヘレグリン、bFGFおよびPDGF-AA)を補充することによってMSCから生成され得るが、表現型の不安定性を示す。成長因子の回収時に、線維芽細胞様表現型7に戻る 。表現型の不安定性は、異常な分化および発癌のリスクのために、細胞移植において望ましくない。シュワン細胞前駆体は、胚末梢神経8内の軸索束と関連しているので、我々は、精製胚DRGニューロン7を共培養SCLCに導きass = "xref"> 9。成熟シュワン細胞は運命決定されており、in vitro 7,9およびin vivo 10で機能を示す

MSCからの神経前駆細胞の濃縮に関する我々のプロトコールは、単純かつ効率的であり、その後のアッセイのための細胞数の増加をもたらす。共培養プラットフォームを介した運命決定シュワン細胞の誘導は、グリア分化の研究、および潜在的な臨床適用のための安定かつ機能的なシュワン細胞の生成を可能にする。

Protocol

動物を含むすべての処置は、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに厳密に準拠して実施され、香港大学の医学のLi Ka Shing教授のための生きた動物の使用に関する委員会によって承認された。インフォームドコンセントを得た後、健康なドナーの腸骨稜からヒト骨髄サンプルを得た。議定書は、香港大学の制度審査委員会の承認を受けています。 1.ラットMSC培養液?…

Representative Results

我々のプロトコルの重要なステージの概要を図1に示します。要約すると、ラットおよびヒトMSCは、組織培養プラスチックの接着によって選択される。拡張されたMSCは、低酸素状態で前処理され、次いで、ニューロスフェア形成条件に供される。ニューロスフェアをプレートし、SCLCに分化させる。 SCLCは、精製されたDRGニューロンと共培養され、…

Discussion

低酸素プレコンディショニングおよびニューロスフェア培養を介して神経前駆細胞を濃縮する前に、MSCの「幹細胞」を保存することが不可欠です。我々の経験から、多分化能MSCは、それらの細長い線維芽様の形態によって確実に同定され得る。対照的に、顕著な細胞骨格ストレスファイバーを有するより平らな四角形形態を採用したMSCは、容易に神経細胞運命を採用せず、廃棄すべきである?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、低酸素室装置を提供してくれたNai-Sum Wong博士と技術サポートのためのAlice Luiさんに感謝したいと思います。

Materials

αMEM Sigmaaldrich M4526
DMEM/F12 Thermofisher scientific 12400-024
Neurobasal medium Thermofisher scientific 21103-049
FBS Biosera FB-1280/500
B27 Thermofisher scientific 17504-001
Epidermal growth factor (EGF) Thermofisher scientific PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech 100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)  Millipore NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) Peprotech 100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) Millipore 01-201
Uridine Sigmaaldrich U3003
5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) Sigmaaldrich F0503
Poly-D-lysine (PDL) Sigmaaldrich P7886-1G
Laminin Thermofisher scientific 23017015
GlutaMAX Thermofisher scientific 35050061
Penicillin / streptomycin (P/S) Thermofisher Scientific 15140-122
TrypLE Express Thermofisher Scientific 12604-013
10 cm plate for adherent culture TPP 93100 Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture TPP 92006 Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture Corning 3471 Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1) BD Biosciences 555593
anti-human CD73 BD Biosciences 550256
anti-human/rat STRO-1 R&D Systems MAB1038
anti-human nestin R&D Systems MAB1259
anti-human CD45 BD Biosciences 555480
anti-rat CD90(Thy-1) BD Biosciences 554895
anti-rat CD73 BD Biosciences 551123
anti-rat nestin BD Biosciences MAB1259
anti-rat CD45 BD Biosciences 554875
Anti-S100β Dako Z031101
Anti-p75 Millipore MAB5386
Anti-GFAP Sigmaaldrich G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) Covance MMS-435P
Anti-Human nuclei Millipore MAB1281
Hypoxia chamber Billups-Rothenberg MIC-101
HEPES buffer Sigmaaldrich H4034-100G

Referências

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Citar este artigo
Tsui, Y., Mung, A. K., Chan, Y., Shum, D. K., Shea, G. K. Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells. J. Vis. Exp. (124), e55794, doi:10.3791/55794 (2017).

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