Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares
Summary
Este trabajo demuestra un nuevo enfoque para evaluar la proliferación, la diferenciación y el potencial de formación de vasos de células madre endoteliales vasculares (VESCs) a través de trasplante de almohadillas de grasa mamaria seguido de preparación de tejido de montaje completo para la observación microscópica. También se presenta una estrategia de seguimiento de linaje para investigar el comportamiento de VESCs in vivo .
Abstract
Las células endoteliales son los bloques fundamentales de la arquitectura vascular y median el crecimiento vascular y la remodelación para asegurar el desarrollo adecuado de los vasos y la homeostasis. Sin embargo, los estudios sobre la jerarquía del linaje endotelial siguen siendo esquivos debido a la falta de herramientas para obtener acceso, así como para evaluar directamente su comportamiento in vivo . Para abordar esta deficiencia, se ha desarrollado un nuevo modelo de tejido para estudiar la angiogénesis utilizando la almohadilla de grasa mamaria. La glándula mamaria se desarrolla principalmente en las etapas posnatales, incluyendo la pubertad y el embarazo, durante los cuales la proliferación robusta del epitelio se acompaña de un extenso remodelado vascular. Las almohadillas de grasa mamaria proporcionan espacio, matriz y estímulos angiogénicos ricos a partir del epitelio mamario en crecimiento. Además, las almohadillas de grasa mamaria están situadas fuera de la cavidad peritoneal, haciéndolas un sitio de injerto fácilmente accesible para evaluar el potencial angiogénico de las células exógenas. Este trabajo también describe unaNt utilizando ratones reporteros fluorescentes para etiquetar específicamente la población diana de células madre endoteliales vasculares (VESCs) in vivo . Este método de rastreo de linaje, junto con la posterior microscopía de montaje completo de tejidos, permite la visualización directa de células diana y sus descendientes, a través de los cuales se puede cuantificar la capacidad de proliferación y el compromiso de diferenciación puede ser asignado al destino. Usando estos métodos, recientemente se ha identificado una población de receptor B bipotente (Procr) que expresa VESCs en múltiples sistemas vasculares. Procr + VESCs, que dan lugar tanto a nuevas CE como a pericitos, contribuyen activamente a la angiogénesis durante el desarrollo, la homeostasis y la reparación de lesiones. En general, este manuscrito describe un nuevo trasplante de almohadillas de grasa mamaria y técnicas de rastreo de linaje in vivo que pueden usarse para evaluar las propiedades de células madre de VESCs.
Introduction
Durante el desarrollo y la homeostasis, el crecimiento vascular y la remodelación se llevan a cabo fielmente de acuerdo con el crecimiento y la reparación del órgano. La angiogénesis describe la generación de nuevos vasos a partir de vasos sanguíneos preexistentes y se considera una fuerza principal que media en estos cambios vasculares dinámicos. Cada vaso sanguíneo está revestido interiormente con una capa de células endoteliales (ECs), y parecen ser la base de la arquitectura de los vasos. Durante mucho tiempo, el mecanismo a través del cual se repone el pool de EC durante la homeostasis permaneció incierto, y se discutieron si la rotación vascular es el resultado de la proliferación madura de la EC o es la contribución de las actividades vasculares de la madre / progenitor. Debido a la falta de evidencia fisiológica directa, la existencia y la identidad celular de las células madre endoteliales vasculares (VESCs) también permanecieron controversiales.
Uno de los métodos más comunes utilizados para verificar el comportamiento de las células madre es a través del transplanTación de células madre putativas en ratones receptores. Este método mide el potencial stemness de células madre candidatas in vivo. El trasplante se aplicó por primera vez al estudio de las células madre de la médula ósea 1 , lo que contribuyó al establecimiento de las características jerárquicas del sistema hematopoyético 2 . En el campo endotelial, un tapón de matriz de membrana basal ( por ejemplo, matrigel) insertado subcutáneamente bajo la piel de flanco ha sido un ensayo de angiogénesis in vivo estándar usado para dirigir las capacidades de formación de vasos de ECs trasplantadas. Múltiples métodos experimentales, incluyendo la formación de colonias en sistemas de cultivo 3D y el trasplante, han sugerido potencial de EC progenitor / VESC poblaciones 3 , 4 , 5 , 6 . Sin embargo, dado que las CE incrustadas en la matriz de la membrana basal están relativamente separadas deEl tejido circundante, esto no proporciona el ambiente de nicho óptimo requerido para explorar completamente el potencial angiogénico de las células trasplantadas. Como resultado, los vasos formados dentro del tapón de la matriz son predominantemente capilares y son funcionalmente no medibles.
La glándula mamaria se desarrolla postnatalmente, con el crecimiento más robusto que se produce durante la pubertad y el embarazo. En la etapa puberal, el epitelio mamario experimenta una rápida expansión, para ocupar toda la almohadilla de grasa mamaria, acompañada de la remodelación eficiente de las estructuras vasculares circundantes. Así, la glándula mamaria ofrece un excelente modelo para el estudio de la angiogénesis. Proporciona espacio, matriz y estímulos angiogénicos ricos a partir del epitelio mamario en crecimiento y por lo tanto es un sitio de injerto ideal para evaluar el potencial angiogénico de células exógenas. Además, la almohadilla de grasa mamaria permite que los vasos exógenos formados se integren con el sistema de circulación del huésped, permitiendo además fY que representan una ventaja sobre el trasplante subcutáneo.
Aunque los ensayos de cultivo y trasplante de vitro son una manera eficaz de investigar las propiedades de regeneración de una población celular, se sabe que tales ensayos pueden estimular la plasticidad cuando las células son retiradas de sus hábitats nativos y pueden ser inducidos cuando las células se desconectan de Su entorno fisiológico 7 . Por lo tanto, obtener la evidencia directa in vivo del destino celular es el enfoque clave para avanzar en la comprensión actual del comportamiento de las poblaciones endoteliales.
El mapeo genético del destino ( es decir, el rastreo del linaje in vivo ) es imprescindible para la identificación de VESCs y para la investigación de sus propiedades en el sistema corporal, ya que puede revelar el comportamiento in vivo de las células madre en su contexto fisiológico y la stemness real puede ser juzgado. Lineage traciNg proporciona evidencia directa de la persistencia a largo plazo ( es decir, auto-renovación) de los VESC candidatos y su capacidad para producir tipos celulares para el tejido de origen ( es decir, la potencia de diferenciación).
Este protocolo describe una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria y un método de seguimiento de linaje para observar la capacidad de generación de vasos de VESCs. Estas técnicas superan las deficiencias de los ensayos disponibles actualmente y proporcionan una nueva forma de evaluar óptimamente las propiedades de las células madre de los VESC. Estos enfoques son herramientas eficientes que pueden usarse para evaluar el comportamiento y las propiedades formadoras de vasos de las poblaciones endoteliales, así como para determinar la alteración de la potencia de las células vasculares en un ambiente patológico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los ensayos de angiogénesis representan un buen enfoque experimental para estudiar la dinámica vascular. La vasculatura retiniana del ratón, que se desarrolla postnatalmente, ha demostrado ser un modelo atractivo para estudiar la angiogénesis [ 12] . A pesar de ser relativamente accesible, la manipulación real dentro del lecho vascular de la retina es bastante difícil. Hasta ahora, el trasplante in vivo mejor descrito ha sido el ensayo de tapón, que encierra células dentro de una…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31530045 y 31371500 a YAZ, 31401245 a QCY), el Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2014CB964800), la Academia China de Ciencias (XDB19000000 a YAZ) y el chino Sociedad de Biología Celular (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
Referências
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