חתך בלוטות החלב שלמות מלא עבור זיהוי הנגע
Summary
פיתחנו שיטה כדי להסיר בהצלחה, לעבד, קטע, כתם, להערכה histopathological, רקמת החלב שנקבע במקור על שקופיות כמו mounts שלם. שיטה זו עשויה לקדם את איסוף והערכה של בלוטת החלב כולו mounts במחקרים הנחייה מבחן הרבייה.
Abstract
התפתחות בלוטת החלב הנורמלית עשויה להשתנות על ידי חשיפה לחומרים רעילים סביבתיים ומוצרים פרמצבטיים, חשיפה מוגזמת להורמונים ושינויים גנטיים. בלוטת החלב כולו mounts הם שיטה זולה כדי ללכוד את התקדמות שינויים מורפולוגיים שעשויים להתעורר לאחר החשיפה. עם זאת, בשלב מאוחר יותר בחיים, כאשר הפרעות נוטות יותר לפתח, ההסתמכות הבלעדית על שיטה אחת זו לא תמיד מספקת מספיק מידע כדי לבצע אבחנה נכונה של חריגות. מבחינה היסטורית, במחקרים כימיים מבחן קו מנחה, בלוטת החלב אחד מוסר ב necropsy ומוכן כמו hematoxylin ו eosin (H & E) מוכתם בסעיף. שילובם של אוסף שלם של חולי כליה וניתוחם מקטין את הסבירות להערכה שלילית שגויה. הערכה של כל הר מוגבל על ידי נוכחות של אחד או שניים בלוטות החלב כולו בשקופית, ובמקרים מסוימים, את הפרעות שנצפו הר שלם הם לאלא מיוצגים באופן אחיד בחלק H & E. מטרת מחקר זה היתה לפתח פרוטוקול להמרת mountsipped כל החלב hs כדי H & E- כתמים מוכתמים כך נגעים שאחרת היה החמיצו או שקשה לאבחן ניתן לזהות. כאן, אנו מפרטים שיטה לייצר באיכות גבוהה, paraffin- מוטבע H & E סעיף מתוך בלוטת החלב כי הוכנה בתחילה כמו הר שלם. לעומת רקמה שהוכנה במתכוון עבור חתך H & E, כל ההר דורש הכנה נוספת להסרת רקמות ועיבוד. עם זאת, שיטה זו נחשבת זולה, כפי שהוא דורש ריאגנטים מעבדה משותפת זמן נוסף קטן. כתוצאה מכך, שיטה זו יכולה לספק מידע רב ערך על איך חשיפות כימיות וסביבתיות לשנות את התפתחות החלב רגילה, כמו גם להציג שינויים המתרחשים בגלל שינויים גנטיים.
Introduction
הכל mountis החלב שיטה שימושית וזולה מיושמת רבים עכברים ועכבר מחקרים כדי להבין הן נורמלי כימית-המושרה, התפתחות חריגה. באופן כללי, בלוטת החלב שנאספה בשלבים שונים במהלך התפתחות המכרסמים ( כלומר, גיל ההתבגרות, ההתבגרות, אמצע עד מאוחר ההריון, ואת שלב הפירוק) יראה שינויים מורפולוגיים בארכיטקטורה רקמות הסלולר מושפעים על ידי פרקרין, האנדוקרינית, גורמים אוטוקרינית 1 . ב עכברוש ההזדקנות, מנות אפיתל ו סטרומה של הבלוטה הופכים צפופים יותר ויותר, מה שהופך מדידה פרמטרים מורפולוגיים קשה בהר שלם. לכן, זה נוהג נפוץ לאסוף בלוטה להערכה היסטולוגית לזהות שינויים ברמה מיקרוסקופית. שני התהליכים שימושיים במיוחד במחקרים העוסקים בחשיפה כימית ( כלומר, סביבתיים או פרמצבטיים) או כדי לבחון את השינויים המורפולוגיים המלווים בגורם גנטיAtions.
טכניקות ויכולות לשימוש בלוטת החלב בהערכת הסיכון ממשיכות להתפתח. בעוד הכנה שלמה הר היא שגרתית סטנדרטית, שינויים חתך להמשיך 2 , 3 . קבוצות מחקר רבות מרקעים שונים (למשל , אקדמיה, ממשל ותעשייה) התאימו חלקים קטנטריים / אורכיים של רקמת החלב כשיטה מועדפת, בעוד שחלק מהמעבדות עדיין משתמשות בקטעים חתוכים דרך העור 4 . השיטה השנייה תוצאות ייצוג מופרז של העור (העור), ולא רקמת עניין: אפיתל בלוטת החלב 2 . חתכים העטרה או האורך הם שימושיים יותר לאפיון רקמות נורמלי 5 לשפר באופן משמעותי את איתור של ליקויים נגעים בשל שטח הפנים מוגברת ומספר המבנים הנוכחיים. בסך הכל, זה עושה את כל מוUnt שיטה מתאימה להערכת histopathological השוואתית של בלוטת החלב 1 , 2 . בין אם באמצעות עכבר או עכברוש, תחזור, ושימור של 4 וה 5 th בלוטות מפשעתי מומלץ מאוד עבור ההשוואה של הר השלם כדי מדור H & E נגדי.
כאשר נעשה שימוש בשילוב, סעיף H & E ואת הר שלם לספק תיאור מדויק של השינויים הסלולר ומורפולוגי הנגרמת על ידי חשיפה סביבתית. זה נכון במיוחד מסוימים זנים מכרסם שבו המודל בעל רגישות נמוכה להיווצרות הגידול או גידול אינו גלוי לעין. בנסיבות מסוימות, לא ניתן תמיד להשיג את הרקמה הנדרשת באמצעות שתי הטכניקות ( כלומר, כמות רקמה לא מספקת, משאבים או תוצאות ניסיוניות בלתי צפויות). במקרה שלנו, הפרעות נצפו הר שלם החלב, ואילו histopathoהממצאים הלוגיים בבלוטת H & E הנגדית היו ברובם נורמליים. הפער המכריע בין הבלוטות הנגדיות הוביל אותנו לפתח הליך חסכוני ויעיל כדי לזהות את החריגות של כל mounts. באמצעות עיבוד עיבוד שונה תהליך ההטבעה, באיכות גבוהה H & E- מוכתמים סעיפים היו מוכנים מ mounts מוטבע paraffin כולו. אנו לדמיין את הפרוטוקול הזה הופך כלי זיהוי רב עוצמה עבור השפעות חשיפה כימית, שיפור השוואות בין המעבדה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הר בלוטת החלב כולו הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי להמחיש את התפתחות החלב הנורמלי שינויים מורפולוגיים שעשויים להתעורר ולהתמיד בעקבות החשיפה לכימיקלים, כולל משברים האנדוקרינית. כאשר כל הר ו H & E סעיף מאותו בעל חיים מוערכים יחד, הם יכולים לספק תמונה חזותית מדויק?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים היו רוצים להכיר פאם Ovwigho, טנט ג 'ונס, ו נטשה קלייטון, NIEHS, על המומחיות הטכנית שלהם תמיכה עם הפרויקט הזה.
Materials
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
Referências
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , (2017).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
