घाव पहचान के लिए स्तन मंडल पूरे माउंटिंग का हिस्सा
Summary
हम हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए, सफलतापूर्वक निकालने, प्रक्रिया, खंड और दाग के लिए एक विधि विकसित की है, मूल रूप से स्लाइड्स पर पूरे माउंट के रूप में निर्धारित किया गया स्तन ऊतक। यह विधि प्रजनन और विकासात्मक परीक्षण दिशानिर्देशों के अध्ययन में स्तन ग्रंथि की पूरी संख्या को संग्रह और मूल्यांकन को बढ़ावा दे सकती है।
Abstract
सामान्य स्तन ग्रंथि के विकास में पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थों और दवा उत्पादों, हार्मोन के लिए अत्यधिक प्रदर्शन और आनुवांशिक परिवर्तन के संपर्क में परिवर्तन किया जा सकता है। स्तन ग्रंथि की संपूर्ण माउंट एक्सपोज़र के बाद उत्पन्न होने वाली रूपात्मक परिवर्तनों की प्रगति पर कब्जा करने के लिए एक सस्ती विधि है। हालांकि, बाद के जीवन में, जब असामान्यताएं विकसित करने के लिए अधिक प्रवण हैं, इस विधि पर एकमात्र निर्भरता हमेशा असामान्यता का उचित निदान करने के लिए पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं कर सकता है ऐतिहासिक रूप से, रासायनिक परीक्षण दिशानिर्देशों के अध्ययन में, एक स्तनमय ग्रंथि नेक्रोस्पॉसी में हटा दिया जाता है और एक हेमटॉक्सीसिलिन और ईसिन (एच एंड ई) -स्टेन्ड सेक्शन के रूप में तैयार किया जाता है। द्विपक्षीय स्तनधारियों के पूरे ढांचे का संग्रह और विश्लेषण एक गलत-नकारात्मक मूल्यांकन की संभावना कम करता है। संपूर्ण माउंट का मूल्यांकन एक स्लाइड पर एक या दो संपूर्ण स्तन ग्रंथियों की उपस्थिति से सीमित है, और कुछ मामलों में, पूरे माउंट में दिखाई जाने वाली असामान्यताएं नहीं हैंटी एच एंड ई अनुभाग में एक समान रूप से प्रतिनिधित्व किया। इस अध्ययन का लक्ष्य एचएंडई-स्टेड वर्गों के लिए कवरलिपि स्तनधारियों के पूरे माउंट को परिवर्तित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का विकास करना था ताकि अन्यथा मिस हो जाने वाले घावों या निदान करने में मुश्किल हो सकें। यहां, हम एक स्तन ग्रंथि से उच्च-गुणवत्ता, पैराफिन-एम्बेडेड एचएंडई अनुभाग बनाने की एक विधि का विस्तार करते हैं, जिसे शुरू में पूरे माउंट के रूप में तैयार किया गया था। जानबूझकर एच एंड ई सेक्शनिंग के लिए तैयार ऊतक की तुलना में, पूरे माउंट को ऊतक हटाने और प्रसंस्करण के लिए अतिरिक्त तैयारी की आवश्यकता होती है। हालांकि, इस विधि को सस्ती माना जाता है, क्योंकि इसमें सामान्य प्रयोगशाला अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है और थोड़ा अतिरिक्त समय होता है। नतीजतन, यह विधि अनमोल सूचना प्रदान करती है कि कैसे रासायनिक और पर्यावरण जोखिम सामान्य स्तन वृद्धि को बदलता है, साथ ही आनुवंशिक संशोधनों के कारण होने वाले परिवर्तन भी प्रदर्शित करता है।
Introduction
स्तनपायी पूरी तरह से कई चूहे और माउस अध्ययनों में कार्यान्वित एक उपयोगी और सस्ती तरीका है जो सामान्य और रासायनिक रूप से प्रेरित, असामान्य विकास दोनों को समझते हैं। सामान्यतः, कृंतक विकास ( यानी, किशोरावस्था, यौवन, देर से गर्भधारण और जुदाई चरण) के दौरान विभिन्न चरणों में एकत्रित एक स्तन ग्रंथि, पैरासीराइन, एंडोक्राइन और ऑटोक्रेइन कारकों से प्रभावित ऊतक और सेलुलर आर्किटेक्चर में रूपात्मक परिवर्तन दिखाएगा। 1 बुढ़ापे चूहे में, ग्रंथि के उपकला और stromal भागों तेजी से घने हो जाते हैं, जो पूरे माउंट में आकृति विज्ञान मापदंडों को मापने के लिए बनाता है। इस प्रकार, सूक्ष्म स्तर पर परिवर्तन की पहचान करने के लिए हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए एक ग्रंथि एकत्र करने के लिए सामान्य अभ्यास होता है। दोनों प्रक्रियाएं विशेष रूप से रासायनिक एक्सपोजर ( यानी पर्यावरण या फार्मास्यूटिकल) से संबंधित अध्ययनों में उपयोगी हैं या आनुवंशिक बदलाव के साथ आकृति परिवर्तनों की जांच करनाations।
जोखिम मूल्यांकन में स्तन ग्रंथि का उपयोग करने के लिए तकनीकों और क्षमताओं का विकास जारी है। पूरे माउंट की तैयारी नियमित और मानकीकृत है, जबकि सेक्शनिंग के संशोधन 2 , 3 जारी रहते हैं। विभिन्न पृष्ठभूमि ( यानी, शिक्षा, सरकार, और उद्योग) के कई शोध समूहों ने स्तनधारी ऊतकों के राज्याभिषेक / अनुदैर्ध्य अनुभागों को पसंदीदा विधि के रूप में रूपांतरित किया है, जबकि कुछ प्रयोगशाला अभी भी त्वचा 4 के माध्यम से क्रॉस-कट वाले वर्गों का उपयोग करते हैं। उत्तरार्द्ध विधि ब्याज के ऊतक की बजाय एपिडर्मिस (त्वचा) के एक असाधारण प्रतिनिधित्व में होता है: स्तन ग्रंथि उपकला 2 कोरोनल या अनुदैर्ध्य अनुभाग सामान्य ऊतक 5 को चित्रित करने के लिए अधिक उपयोगी होते हैं और बढ़ सतह क्षेत्र और उपस्थित संरचनाओं की संख्या के कारण असामान्यताएं और घावों का पता लगाने में काफी सुधार होता है। कुल मिलाकर, यह पूरे मो बनाता हैस्तन ग्रंथि 1 , 2 के तुलनात्मक हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए एक उपयुक्त विधि के रूप में चाहे माउस या चूहा, पुनर्प्राप्ति, और 4 वें और 5 वें इंन्गल ग्रंथियों के संरक्षण का प्रयोग पूरे माउंट की तुलना एक समवर्ती एच एंड ई सेक्शन के लिए किया जाता है।
जब संयोजन में उपयोग किया जाता है, तो एच एंड ई अनुभाग और पूरे माउंट पर्यावरण के जोखिम से प्रेरित सेलुलर और आकारिकी के सटीक खाते प्रदान करते हैं। यह विशेष रूप से कुछ कृंतक उपभेदों में सच है जिसमें मॉडल में ट्यूमर के गठन की कम संवेदनशीलता होती है या एक ट्यूमर मोटे तौर पर दिखाई नहीं देता है। कुछ परिस्थितियों में, आवश्यक टिशू प्राप्त करना दोनों तकनीकों ( यानी अपर्याप्त ऊतक मात्रा, संसाधन, या अप्रत्याशित प्रयोगात्मक परिणाम) का उपयोग करके हमेशा संभव नहीं हो सकता है। हमारे मामले में, मार्मिक पूरे माउंट में असामान्यताएं देखी गईं, जबकि हिस्टोपैथोद्विपक्षीय एच एंड ई ग्रंथि में तार्किक निष्कर्ष अधिकतर सामान्य थे। द्विगुणित ग्रंथियों के बीच भारी विसंगति ने हमें पूरे माउंट में असामान्यताओं की पहचान करने के लिए एक किफायती और कुशल प्रक्रिया विकसित की। संशोधित प्रसंस्करण और एम्बेडिंग प्रक्रिया का उपयोग करना, पैराफिन-एम्बेडेड संपूर्ण माउंट से उच्च-गुणवत्ता वाली एचएंडई-स्टेन्ड अनुभाग तैयार किए गए थे। हम इस प्रोटोकॉल को रासायनिक प्रदर्शन प्रभावों के लिए एक शक्तिशाली पहचान उपकरण बनने, इंटर-लैब तुलना को बढ़ाने के लिए कल्पना करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्तन ग्रंथि पूरे माउंट एक शक्तिशाली उपकरण है जिसका उपयोग सामान्य स्तन विकास और रूपात्मक परिवर्तनों को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकता है जो उत्पन्न हो सकता है और अंतःस्रावी विघटनकारी सहित रसायनों के …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को इस परियोजना के साथ अपनी तकनीकी विशेषज्ञता और सहायता के लिए पैम ओवविगो, टेनेट जोन्स, और नताशा क्लेटन, एनआईईएचएस को स्वीकार करना चाहूंगा।
Materials
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
Referências
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , (2017).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
