Seksjon Mammary Gland Whole Mount for Lesion Identification

Summary

Vi utviklet en metode for å fjerne, behandle, delte og flekke, for histopatologisk evaluering, brystvev som ble opprinnelig festet på lysbilder som hele fester. Denne metoden kan fremme innsamling og evaluering av brystkjertel hele fester i reproduktiv og utviklingstest retningslinjestudier.

Abstract

Normal brystkjertelutvikling kan endres ved eksponering for miljøgifter og farmasøytiske produkter, overdreven eksponering for hormoner og genetiske endringer. Mammekirtler hele fester er en billig metode for å fange utviklingen av morfologiske endringer som kan oppstå etter eksponering. Imidlertid, i senere liv, når unormaliteter er mer tilbøyelige til å utvikle, kan det bare være nok avhengig av denne metoden å gi nok informasjon for å gjøre en riktig diagnose av unormaliteten. Historisk sett, i kjemiske test retningslinjestudier, fjernes en enkelt brystkjertel ved nekropsy og prepareres som en hematoksylin og eosin (H & E) -farget seksjon. Inkorporeringen av kontralaterale brystsamlinger og -analyser reduserer sannsynligheten for en falsk-negativ vurdering. Evaluering av hele fjellet er begrenset av tilstedeværelsen av en eller to hele brystkirtler på et lysbilde, og i noen tilfeller er abnormaliteter observert i hele fjellet ikkeT er jevnt representert i H & E-delen. Målet med denne studien var å utvikle en protokoll for å omdanne dekkede brystfyllinger til H & E-fargede seksjoner slik at lesjoner som ellers ville vært savnet eller som er vanskelige å diagnostisere, kan identifiseres. Her beskriver vi en metode for å produsere en høyverdig, paraffin-innebygd H & E-seksjon fra en brystkjertel som opprinnelig ble tilberedt som en hel montering. I forhold til et vev som var forsettlig forberedt på H & E-seksjon, krever hele fjellet ytterligere forberedelse for fjerning og behandling av vev. Denne metoden anses imidlertid billig, da det krever vanlige laboratoriereagenser og lite ekstra tid. Som et resultat kan denne metoden gi uvurderlig informasjon om hvordan kjemiske og miljømessige eksponeringer endrer normal brystutvikling, samt viser endringer som oppstår på grunn av genetiske modifikasjoner.

Introduction

Mammas hele fjellet er en nyttig og rimelig metode implementert i mange rott- og musestudier for å forstå både normal og kjemisk indusert, unormal utvikling. Generelt vil en brystkirtel samlet i ulike stadier under utvikling av gnagere ( dvs. ungdomsår, pubertet, mellom- til sen-svangerskap og invasjonsfasen), vise morfologiske forandringer i vev og cellulær arkitektur påvirket av parakrine, endokrine og autokrine faktorer ¹ . I den aldrende rotte blir epithelial- og stromale delene av kjertelen stadig tettere, noe som gjør det vanskelig å måle morfologiske parametere i en hel montering. Således er det vanlig å samle en kjertel for histologisk evaluering for å identifisere endringer på et mikroskopisk nivå. Begge prosessene er spesielt nyttige i studier som involverer kjemisk eksponering ( dvs. miljø- eller farmasøytisk) eller å undersøke de morfologiske forandringene ledsaget av genetisk alterasjon.

Teknikker og evner for bruk av brystkjertelen i risikovurdering fortsetter å utvikle seg. Mens helmontert forberedelse er rutinemessig og standardisert, fortsetter modifikasjoner for snitting ^{2 , 3} . Mange forskergrupper fra ulike bakgrunner ( dvs. akademia, regjeringen og industrien) har tilpasset koronale / langsgående deler av brystvev som en foretrukket metode, mens enkelte laboratorier fortsatt bruker kryssnitt gjennom huden ⁴ . Sistnevnte metode resulterer i en overdreven representasjon av epidermis (hud), snarere enn det vev av interesse: brystkjertelepitelet ² . Koronale eller langsgående seksjoner er mer nyttige for å karakterisere normalt vev ⁵ og sterkt forbedre påvisning av abnormiteter og lesjoner på grunn av det økte overflateareal og antall strukturer som er til stede. Samlet sett gjør dette hele mount en passende metode for sammenlignings histopatologisk vurderingen av melkekjertelen ^{1, 2.} Uansett om du bruker en mus eller en rotte, henting og bevaring av den ^fjerde og ^femte tarmkirtlen, anbefales det sterkt å sammenligne hele fjellet til en kontralateral H & E-seksjon.

Når de brukes i kombinasjon, gir H & E-delen og hele monteringen en nøyaktig beskrivelse av de cellulære og morfologiske forandringene som er forårsaket av miljøpåvirkning. Dette gjelder spesielt i visse gnagestammer hvor modellen har lav mottakelighet for dannelse av svulster, eller en svulst er ikke grovt synlig. Under noen omstendigheter er det ikke alltid mulig å skaffe det nødvendige vevet ved hjelp av begge teknikkene ( dvs. utilstrekkelig vevsmengde, ressurser eller uventede eksperimentelle resultater). I vårt tilfelle ble abnormiteter observert i hele brystet, mens histopathoLogiske funn i kontralateralt H & E-kjertel var for det meste normale. Den overveldende uoverensstemmelsen mellom de kontralaterale kjertlene førte oss til å utvikle en økonomisk og effektiv prosedyre for å identifisere abnormaliteter i hele monteringen. Ved bruk av en modifisert prosesserings- og innlejringsprosedyre ble høykvalitets H & E-fargede seksjoner fremstilt fra paraffin-innebygde hele fester. Vi ser på at denne protokollen blir et kraftig gjenkjenningsverktøy for kjemiske eksponeringseffekter, og forbedrer interlab-sammenligninger.

Protocol

All dyrebruk og prosedyrer for denne studien ble godkjent av NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee og utført i en forening for vurdering og akkreditering av Laboratory Animal Care-akkreditert anlegg. 1. Mammary Whole Mount forberedelse 2 , 3 , 6 , 7 Fjern de inguinale brystkjertlene fra den ene siden av en ikke-gravid CD-1 kvinnelig mus, som beskrev…

Representative Results

Denne metoden er effektiv til å bistå med diagnoser som ellers kan ha blitt savnet hvis den opprinnelige kontralaterale H & E-delen av brystvorten ikke viste noen histologiske endringer. Utfallet vil imidlertid kun være nyttig dersom det tas hensyn til det første preparatet, samt under forberedelsen av vevet til den histologiske evalueringen. Paraffinbøyning gir beskyttelse og vil bidra til å bevare vevet for fremtidig seksjonering. <p class="jove_content" fo:keep-together….

Discussion

Brystkjertelen hele fjellet er et kraftig verktøy som kan brukes til å illustrere den normale brystutviklingen og morfologiske endringer som kan oppstå og vedvarer etter eksponering for kjemikalier, inkludert hormonforstyrrelser. Når en helfest og H & E-seksjon fra det samme dyret vurderes sammen, kan de gi et nøyaktig visuelt øyeblikksbilde av tidlige endringer som kan utvikle seg til en mer sjukt tilstand.

Evnen til å oppnå denne nyttige informasjonen ligger i å sørge for at …

Materials

Xylene	Sigma-Aldrich	214736
Permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-100	mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections
Leica automated processor	Leica Biosystems	Model # ST5020
HM 355S Automatic Microtome	Thermo Fisher Scientific	905200
Paraffin	Leica Biosystems	EM-400
Superfrost plus microscope slides	Thermo Fisher Scientific	4951PLUS-001	electrostatically charged
Fisher Finest 24x60x1	Thermo Fisher Scientific	12-548-5P	coverslips
Varistain Gemini ES Automatic slide stainer	Thermo Fisher Scientific	A78000014
Sta-On	Leica Biosystems	3803107	liquid adhesive; used in water bath at sectioning
Modified Harris Hematoxylin 72711	Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific)	72711
Eosin	Leica Biosystems	3801600
Lithium Carbonate	SkyTech Laboratories	LCQ500
Glacial Acetic Acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	needed in Carnoy's fixative
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4440-04	needed in Carnoy's fixative
100% Ethanol	The Warner Graham Company	6505001050000	needed in Carnoy's fixative and washing slides
95% Ethanol	The Warner Graham Company	6505011137320190
Carmine Alum	Sigma-Aldrich	C1022-25G
Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra	Sigma-Aldrich	A7210-500G
Automation wash buffer, 20X	Biocare Medical	TWB945