Разделение молочных желез всех мест для идентификации поражения
Summary
Мы разработали метод для успешного удаления, обработки, разделения и окрашивания, для гистопатологической оценки, ткани молочной железы, которая первоначально была закреплена на слайдах в качестве целого. Этот метод может способствовать сбору и оценке целых гормонов молочной железы в исследованиях репродуктивного и развивающего тестирования.
Abstract
Нормальное развитие молочной железы может быть изменено путем воздействия токсинов окружающей среды и фармацевтических продуктов, чрезмерного воздействия гормонов и генетических изменений. Универсальные скопления молочной железы – это недорогой метод для фиксации изменений морфологических изменений, которые могут возникнуть после воздействия. Однако в более поздней жизни, когда аномалии более склонны к развитию, единственная зависимость от этого метода может не всегда обеспечивать достаточную информацию, чтобы сделать правильный диагноз аномалии. Исторически, в исследованиях по химическим испытаниям, единичная молочная железа удаляется при вскрытии и готовится в виде участка, подверженного гематоксилину и эозину (H & E). Внедрение коллекции и анализа контралатеральной молочной железы для всего тела уменьшает вероятность ложноотрицательной оценки. Оценка всего гора ограничена наличием одной или двух целых молочных желез на слайде, а в некоторых случаях нарушения, наблюдаемые во всем кресле, не являютсяT, равномерно представленный в разделе H & E. Цель этого исследования заключалась в разработке протокола для преобразования покрытых оболочкой масок общего назначения в окрашенные H & E участки, чтобы можно было выявить поражения, которые в противном случае были бы упущены или которые трудно диагностировать. Здесь мы подробно остановимся на способе получения высококачественной, вложенной в парафин секции H & E из молочной железы, которая была первоначально приготовлена в виде всего гора. По сравнению с тканью, которая была специально подготовлена для секреции H & E, для всего крепления требуется дополнительная подготовка к удалению и обработке тканей. Однако этот метод считается недорогим, так как он требует общих лабораторных реактивов и небольшого дополнительного времени. В результате этот метод может предоставить бесценную информацию о том, как химические и экологические воздействия изменяют нормальное развитие молочных желез, а также демонстрируют изменения, которые происходят из-за генетических модификаций.
Introduction
Основа для молочных желез – полезный и недорогой метод, реализованный во многих исследованиях крыс и мышей, чтобы понять как нормальное, так и химически вызванное ненормальное развитие. В целом, молочная железа, собранная на разных стадиях развития грызунов ( т. Е. Отрочество, половое созревание, от середины до позднего срока беременности и фаза инволюции), проявит морфологические изменения в тканевой и клеточной архитектуре под влиянием паракринного, эндокринного и аутокринного факторов 1 . У стареющей крысы эпителиальная и стромальная части железы становятся все более плотными, что затрудняет измерение морфологических параметров в целом. Таким образом, общепринятой практикой является сбор железы для гистологической оценки для выявления изменений на микроскопическом уровне. Оба процесса особенно полезны в исследованиях, связанных с воздействием химических веществ ( например, на окружающую среду или фармацевтические препараты) или на изучение морфологических изменений, сопровождающихся генетическим изменениемations.
Методы и возможности для использования молочной железы в оценке риска продолжают развиваться. Несмотря на то, что подготовка на всех этапах является обычной и стандартизированной, изменения в разрезе продолжаются 2 , 3 . Многие исследовательские группы из разных слоев общества ( например, академии, правительства и промышленности) адаптировали корональные / продольные отделы ткани молочной железы в качестве предпочтительного метода, в то время как в некоторых лабораториях все еще используются поперечные срезы через кожу 4 . Последний метод приводит к чрезмерному представлению эпидермиса (кожи), а не к интересующей ткани: эпителий молочной железы 2 . Корональные или продольные секции более полезны для характеристики нормальной ткани 5 и значительно улучшают обнаружение аномалий и поражений из-за увеличенной площади поверхности и количества присутствующих структур. В целом, этоНе подходящий метод сравнительной гистопатологической оценки молочной железы 1 , 2 . Рекомендуется ли использовать мышь или крысу, поиск и сохранение 4- й и 5- й паховых желез, для сравнения всего монтирования с контралатеральной секцией H & E.
При использовании в комбинации секция H & E и целая гора обеспечивают точный учет клеточных и морфологических изменений, вызванных воздействием окружающей среды. Это особенно верно в отношении некоторых штаммов грызунов, в которых модель обладает низкой восприимчивостью к образованию опухолей или опухоль не является чрезвычайно заметной. В некоторых случаях получение требуемой ткани не всегда возможно с использованием обеих методик ( т. Е. Недостаточного количества ткани, ресурсов или неожиданных результатов эксперимента). В нашем случае аномалии наблюдались в молочной железе, а гистопатоЛогические выводы в контралатеральной H & E железы были в основном нормальными. Подавляющее несоответствие между контралатеральными железами привело нас к разработке экономичной и эффективной процедуры для выявления аномалий во всех горах. Используя модифицированную процедуру обработки и встраивания, высококачественные участки, окрашенные H & E, были получены из встроенных в парафинов креплений. Мы предполагаем, что этот протокол станет мощным средством обнаружения химических эффектов воздействия, что улучшает межлабораторные сравнения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Общая гормональная железа – это мощный инструмент, который может быть использован для иллюстрации нормального развития молочной железы и морфологических изменений, которые могут возникать и сохраняться после воздействия химических веществ, включая эндокринные разрушители. Когда це?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать Pam Ovwigho, Tenette Jones и Наташу Клейтон, NIEHS, за их технический опыт и поддержку в этом проекте.
Materials
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
Referências
- Rudel, R. A., Fenton, S. E., Ackerman, J. M., Euling, S. Y., Makris, S. L. Environmental exposures and mammary gland development: State of the science, public health, implications, and research recommendations. Environ Health Perspect. 119 (8), 1053-1061 (2011).
- Keenan, K. P., Wallig, M. A., Hascheck, W. M. Nature via Nurture: Effect of Diet on Health, Obesity, and Safety Assessment. Toxicol Pathol. 41 (2), 190-209 (2013).
- Stanko, J. P., Fenton, S. E. Quantifying branching density in rat mammary gland whole mounts using the Sholl analysis method. J Vis Exp. , (2017).
- Filgo, A. J., et al. Mammary gland evaluation in juvenile toxicity studies: Temporal developmental patterns in the male and female Harlan Sprague Dawley Rat. Toxicol Pathol. 44 (7), 1034-1058 (2016).
- Tucker, D. K., Foley, J. K., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of high-quality hematoxylin and eosin-stained sections from rodent mammary gland whole mounts for histopathologic review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
- Hvid, H., Thorup, O., Oleksiewicz, M. B., Sjogren, I., Jensen, H. E. An alternative method for preparation of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Path. 63 (4), 317-324 (2011).
- Munoz-de-Toro, M., et al. Perinatal exposure to bisphenol-A alters peripubertal mammary gland development in mice. Endocrinology. 146 (9), 4138-4147 (2005).
- Padilla-Banks, E., Jefferson, W. N., Newbold, R. Neonatal exposure to the phytoestrogen genistein alters mammary gland growth and developmental programming of hormone receptor levels. Endocrinology. 147 (10), 4871-4882 (2006).
- Nikaido, Y., et al. Effects of maternal xenotestrogen exposure on development of the reproductive tract and mammary gland in female CD-1 mouse offspring. Reprod Toxicol. 18 (6), 803-811 (2004).
