تقييم الشبكة شبكية الكالسيوم إزالة الكالسيوم االنبساطي الاحتياطي وداخل الخلايا في Cardiomyocytes البطين المعزولة

Summary

إعادة تدوير الكالسيوم داخل الخلية يلعب دوراً حاسما في تنظيم وظيفة الانقباضي والانبساطي في cardiomyocytes. هنا، نحن تصف وضع بروتوكول لتقييم الشبكة شبكية Ca^{2 +} الاحتياطي ووظيفة إزالة الكالسيوم الانبساطي في cardiomyocytes كالسيوم نظام التصوير.

Abstract

إعادة تدوير الكالسيوم داخل الخلية يلعب دوراً حاسما في تنظيم وظيفة الانقباضي والانبساطي في cardiomyocytes. بمثابة القلب شبكية الشبكة (SR) Ca^{2 +} خزان للانكماش، الذي ريوبتاكيس داخل الخلايا Ca^{2 +} أثناء الاسترخاء. المتاحة لفوز ريال Ca^{2 +} الاحتياطي بعوض للقلب كونتراكتيبيليتي، وإزالة المرجع المصدق داخل الخلية^{2 +} حاسمة بالنسبة لوظيفة القلب الانبساطي. إزالة الكالسيوم البصر وريال Ca^{2 +} مخزن في cardiomyocytes تحت بعض الظروف الفيزيولوجية المرضية، مثل داء السكري والقلب، قد تكون ضالعة في التقدم من اختلال وظيفي في القلب. هنا، يمكننا وصف بروتوكول تقييم سركا^{2 +} الاحتياطي والانبساطي Ca^{2 +} إزالة. بإيجاز، كارديوميوسيتي واحد انزيماتيكالي معزولة، وسجلت داخل الخلية Ca^{2 +} fluorescence المؤشرة Fura-2 بنظام تصوير كالسيوم. استخدام الكافيين لحفز مجموع ريال Ca^{2 +} الإصدار، نحن مسبقاً برنامج تبديل تلقائي التروية بالربط بين نظام التحفيز ونظام التروية. ثم استخدمت تركيب منحنى أسي مونو لتحليل الثوابت وقت تسوس من العابرين الكالسيوم والحبوب الكالسيوم الناجم عن الكافيين. وبناء على ذلك، المساهمة من ريال Ca^{2 +}-ATPase (سيركا) و Na⁺-Ca^{2 +} مبادل (نك) لإزالة الكالسيوم االنبساطي قيمت.

Introduction

الكالسيوم داخل الخلايا ([Ca^{2 +}]_أنا) إعادة التدوير يلعب دوراً حاسما في تنظيم وظيفة الانقباضي والانبساطي في cardiomyocytes¹. كما نعلم، يبدأ المستحثة بالكالسيوم Ca^{2 +} الإفراج عن الإثارة-تقلص اقتران، الذي ترجمة الإشارة الكهربائية إلى الانكماش. ينشط ديبولاريزيشن غشاء ساركوليمال لتر من نوع Ca^{2 +} قنوات، مما يدفع Ca^{2 +} الإصدار من ريال إلى السيتوبلازم عن طريق مستقبلات ريانوديني 2 (RyR2). عابر مرتفعة هيولى Ca^{2 +} يبدأ انكماش ميوفيبريلس. أثناء االنبساط، كاليفورنيا هيولى^{2 +} ريوبتاكين إلى ريال عن طريق ريال Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) ويتم ضخها من كارديوميوسيتي عن طريق ال غ⁺-Ca^{2 +} مبادل (نك)². هذه العملية تؤدي إلى انكماش-الاسترخاء إعادة التدوير في كارديوميوسيتي.

ريال القلب هو شبكة غشاء داخل الخلايا التي تحيط بالآلية الهوس. هو بمثابة Ca^{2 +} خزان للانكماش، وأنها ريبسوربس Ca داخل الخلية^{2 +} أثناء الاسترخاء. المتاحة لفوز ريال Ca^{2 +} الاحتياطي بعوض للقلب كونتراكتيليتي. وفي الوقت نفسه، إزالة المرجع المصدق داخل الخلية^{2 +} أمر بالغ الأهمية للقلب االنبساط. تحت بعض الظروف الفيزيولوجية المرضية، مثل السكري والقلب والبصر Ca^{2 +} التخليص وكاليفورنيا ريال الاكتئاب^{2 +} مخزن في cardiomyocytes يمكن أن يشارك في عملية الخلل في القلب^{2،3 ،4}.

لقياس ريال Ca^{2 +} الإصدار و Ca^{2 +} إزالة الانبساطي في cardiomyocytes، هناك نهجان المستخدمة على نطاق واسع: سلامة الحالي نك استناداً إلى التصحيح-المشبك^5،6، والمرجع المصدق الناجم عن الكافيين ^{2 +} نبض استناداً إلى Ca^{2 +} fluorescence التصوير^7،،من⁸⁹. النهج السابق الذي يعتمد على حقيقة أن Ca^{2 +} صدر من ريال إلى حد كبير تضخ الخروج من الزنزانة التي نك. ومع ذلك، يقتصر هذا النهج باحتياجاتها من المعدات المتطورة والعملية ماهراً. في الدراسة الحالية، ويصف لنا نهجاً ملائماً لتقييم ريال Ca^{2 +} الاحتياطي و Ca^{2 +} إزالة في ميوسيتيس عن طريق قياس الناجم عن الكافيين Ca^{2 +} نبض استناداً Ca^{2 +} fluorescence نظام تصوير. باختصار، يتم الإشارة إلى Ca^{2 +} الأسفار داخل الخلايا Fura-2. بالربط بين نظام التحفيز ونظام التروية، فإننا نعرض برنامجا للتحول نضح وسرعة النظام تلقائياً. واستخدمت 10 ملم من الكافيين للحث على سرعة مجموع Ca^{2 +} الإصدار في ريال. الثوابت وقت تحلل أسي (تاو) من العابرين الكالسيوم والحبوب الكالسيوم الناجم عن الكافيين انتزعت من منحنى أسي مونو والمناسب، والتي تعكس مساهمة سيركا ونككس إلى Ca^{2 +} إزالة االنبساطي تبعاً لذلك.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها لجنة الاستخدام في مركز البحوث التجريبية والصين الأكاديمية الصينية العلوم الطبية وجامعة تشجيانغ ورعاية الحيوان المؤسسية. 1-“إعداد الحل” إعداد جميع الحلول كما هو موضح في الجدول 1. <p class="j…

Representative Results

نحن هنا، لتوضيح بالستريبتوزوتوسين (STZ)-التي يسببها السكري الفئران (مارك ألماني) والعمر-مطابقة سبراغ-داولي (SD) الجرذان على سبيل المثال. تلقي عمرها 8 الأسبوع ذكور الفئران SD (200 ± 20 غ) حقنه داخل واحدة من STZ (70 مغ/كغ، والملكية الفكرية) لمارك ألماني المجموعة أو سترات المخزن المؤقت ل…

Discussion

تدفق الكالسيوم من ريال هو Ca^{2 +} المصدر الرئيسي االنقباض في القلب. لحد والسعة لريال Ca^{2 +} المحتوى Ca كسرية^{2 +} صدر من ريال تعكس متاح لتقلص القلب ريال Ca^{2 +} الاحتياطي. من ناحية أخرى، Ca^{2 +} احتياطي ريال يعتمد على قدرة ريال Ca^{2 +} امتصاص Ca^{2 +} تسرب من ريال وتوازنها عبر ري…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436