Intracellulære calcium genanvendelse spiller en afgørende rolle i reguleringen af systolisk og diastolisk funktion i cardiomyocytes. Her, beskriver vi en protokol for at vurdere sarcoplasmic reticulum Ca2 + reserve og diastolisk calcium fjernelse funktion i cardiomyocytes af en calcium imaging system.
Intracellulære calcium genanvendelse spiller en afgørende rolle i reguleringen af systolisk og diastolisk funktion i cardiomyocytes. Hjerte sarcoplasmic reticulum (SR) fungerer som en Ca2 + reservoir for sammentrækning, hvilke reuptakes intracellulære Ca2 + under afslapning. SR Ca2 + reserve til beats er praecise for hjerte contractibility, og fjernelse af intracellulære Ca2 + er kritisk for diastolisk hjertefunktion. Under nogle patofysiologiske tilstande, såsom diabetes og hjertesvigt, kan nedsat calcium clearance og SR Ca2 + butik i cardiomyocytes inddrages i udviklingen af cardiac dysfunktion. Her, beskriver vi en protokol for at vurdere SRCa2 + reserve og diastolisk Ca2 + fjernelse. Kort, et enkelt cardiomyocyte blev enzymatisk isoleret, og den intracellulære Ca2 + fluorescens drejehastigheden Fura-2 blev optaget af et calcium imaging system. For at ansætte koffein for inducerende samlede SR Ca2 + release, forudindstillede vi en automatisk perfusion switchprogram af interlinking-mekanismen stimulation- og perfusion-systemet. Derefter, mono-eksponentialkurve montering blev brugt til at analysere henfald tid konstanter af calcium transienter og koffein-induceret calcium pulser. I overensstemmelse hermed, bidrag fra SR Ca2 +-ATPase (SERCA) og Na+-Ca2 + exchanger (NCX) til diastolisk calcium fjernelse blev evalueret.
Intracellulære calcium ([Ca2 +]jeg) genanvendelse spiller en afgørende rolle i reguleringen af systolisk og diastolisk funktion i cardiomyocytes1. Som vi ved, indleder calcium-induceret Ca2 + release excitation-sammentrækning kobling, hvilket oversætte det elektriske signal til sammentrækning. Membran depolarisering aktiverer sarcolemmal L-type Ca2 + kanaler, som inducerer Ca2 + udledning fra SR i cytoplasma via ryanodine receptorer 2 (RyR2). Den forbigående forhøjede cytoplasmatisk Ca2 + indleder sammentrækning af myofibrils. Under diastolen, cytoplasmatisk Ca2 + er reuptaken i SR med SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) og pumpes ud af cardiomyocyte via Na+-Ca2 + exchanger (NCX)2. Denne proces fører til sammentrækning-lempelse genbrug i cardiomyocyte.
Den kardiale SR er en intracellulær membran netværk, der omgiver de kontraktile maskineri. Det tjener som en Ca2 + reservoir for sammentrækning, og det reabsorbs intracellulære Ca2 + under afslapning. SR Ca2 + reserve til beats er praecise for hjertets kontraktilitet. I mellemtiden, fjernelse af intracellulære Ca2 + er kritisk for kardiale diastolen. Nogle patofysiologiske betingelser såsom diabetes og hjertesvigt, nedsat Ca2 + clearance og deprimeret SR Ca2 + kan butik i cardiomyocytes være involveret i processen med hjerte dysfunktion2,3 ,4.
Til måling af SR Ca2 + release og diastolisk Ca2 + fjernelse i cardiomyocytes, der er to udbredte tilgange: integriteten af NCX nuværende baseret på patch-klemme5,6, og koffein-induceret Ca 2 + pulse baseret på Ca2 + fluorescens imaging7,8,9. Den tidligere tilgang afhænger det faktum, at den Ca2 + frigivet fra SR er i vid udstrækning pumpes ud af cellen af NCX. Dog, denne fremgangsmåde er begrænset af sine krav af avanceret udstyr og dygtige drift. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en praktisk tilgang til at vurdere SR Ca2 + reserve og Ca2 + fjernelse i myocytes ved at måle en koffein-induceret Ca2 + pulse baseret på en Ca2 + fluorescens imaging system. Kort, intracellulære Ca2 + Fluorescens er indiceret ved Fura-2. Ved en sammenknytning af stimulation system og perfusion, præsenterer vi et program for skifter perfusion og pacing system automatisk. 10 mM koffein var ansat til hurtigt inducerer samlede Ca2 + udgivelse i SR. Eksponentiel henfald tid konstanter (Tau) af calcium transienter og koffein-induceret calcium pulser blev indhentet fra mono-eksponentiel kurve montering, som afspejler SERCA og NCX bidrag til diastolisk Ca2 + fjernelse i overensstemmelse hermed.
Calcium flux frigivet fra SR er den største Ca2 + kilde for systole i hjertet. Til nogle omfang, amplitude af SR Ca2 + indhold og fraktioneret Ca afspejler2 + frigivet fra SR den SR Ca2 + reserve tilgængelige for hjertets sammentrækning. På den anden side afhænger Ca2 + reserven af SR af SR Ca2 + reuptake, Ca2 + lækage af SR og deres balance evne på tværs af SR under diastolen12,13</su…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81100159, Dongwu Lai, 81401147, Juhong Zhang), medicinske og sundhed Science Program af Zhejiang provinsen (nr. 201646246, Dongwu Lai) og den Sundhedsvidenskab og Teknologi Plan af Hangzhou City (No. 2013A28, Ding Lin).
NaCl | Alfa Aesar | E31K43 | |
MgCl2 | Alfa Aesar | I02T070 | |
KCl | Alfa Aesar | G22u018 | |
HEPEs | Sigma | SLBM 7880V | |
D-Glucose | Alfa Aesar | 10189341 | |
NaOH | Alfa Aesar | 10154048 | |
KOH | Alfa Aesar | 10144B17 | |
KH2PO4 | Alfa Aesar | F21S033 | |
MgSO4 | Alfa Aesar | C31U038 | |
L-Glutamic | Alfa Aesar | 10149849 | |
Taurine | Alfa Aesar | J5407a | |
EGTA | Sigma | SLBM6826V | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Collagenase Type II | Worthington | 45k16005 | |
BSA | Roche | 735094 | |
caffeine | Sigma | C0750 | |
Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |