Vurdering af Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve og intracellulære diastolisk Calcium fjernelse i isolerede ventrikulær Cardiomyocytes

Summary

Intracellulære calcium genanvendelse spiller en afgørende rolle i reguleringen af systolisk og diastolisk funktion i cardiomyocytes. Her, beskriver vi en protokol for at vurdere sarcoplasmic reticulum Ca^{2 +} reserve og diastolisk calcium fjernelse funktion i cardiomyocytes af en calcium imaging system.

Abstract

Intracellulære calcium genanvendelse spiller en afgørende rolle i reguleringen af systolisk og diastolisk funktion i cardiomyocytes. Hjerte sarcoplasmic reticulum (SR) fungerer som en Ca^{2 +} reservoir for sammentrækning, hvilke reuptakes intracellulære Ca^{2 +} under afslapning. SR Ca^{2 +} reserve til beats er praecise for hjerte contractibility, og fjernelse af intracellulære Ca^{2 +} er kritisk for diastolisk hjertefunktion. Under nogle patofysiologiske tilstande, såsom diabetes og hjertesvigt, kan nedsat calcium clearance og SR Ca^{2 +} butik i cardiomyocytes inddrages i udviklingen af cardiac dysfunktion. Her, beskriver vi en protokol for at vurdere SRCa^{2 +} reserve og diastolisk Ca^{2 +} fjernelse. Kort, et enkelt cardiomyocyte blev enzymatisk isoleret, og den intracellulære Ca^{2 +} fluorescens drejehastigheden Fura-2 blev optaget af et calcium imaging system. For at ansætte koffein for inducerende samlede SR Ca^{2 +} release, forudindstillede vi en automatisk perfusion switchprogram af interlinking-mekanismen stimulation- og perfusion-systemet. Derefter, mono-eksponentialkurve montering blev brugt til at analysere henfald tid konstanter af calcium transienter og koffein-induceret calcium pulser. I overensstemmelse hermed, bidrag fra SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) og Na⁺-Ca^{2 +} exchanger (NCX) til diastolisk calcium fjernelse blev evalueret.

Introduction

Intracellulære calcium ([Ca^{2 +}]_jeg) genanvendelse spiller en afgørende rolle i reguleringen af systolisk og diastolisk funktion i cardiomyocytes¹. Som vi ved, indleder calcium-induceret Ca^{2 +} release excitation-sammentrækning kobling, hvilket oversætte det elektriske signal til sammentrækning. Membran depolarisering aktiverer sarcolemmal L-type Ca^{2 +} kanaler, som inducerer Ca^{2 +} udledning fra SR i cytoplasma via ryanodine receptorer 2 (RyR2). Den forbigående forhøjede cytoplasmatisk Ca^{2 +} indleder sammentrækning af myofibrils. Under diastolen, cytoplasmatisk Ca^{2 +} er reuptaken i SR med SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) og pumpes ud af cardiomyocyte via Na⁺-Ca^{2 +} exchanger (NCX)². Denne proces fører til sammentrækning-lempelse genbrug i cardiomyocyte.

Den kardiale SR er en intracellulær membran netværk, der omgiver de kontraktile maskineri. Det tjener som en Ca^{2 +} reservoir for sammentrækning, og det reabsorbs intracellulære Ca^{2 +} under afslapning. SR Ca^{2 +} reserve til beats er praecise for hjertets kontraktilitet. I mellemtiden, fjernelse af intracellulære Ca^{2 +} er kritisk for kardiale diastolen. Nogle patofysiologiske betingelser såsom diabetes og hjertesvigt, nedsat Ca^{2 +} clearance og deprimeret SR Ca^{2 +} kan butik i cardiomyocytes være involveret i processen med hjerte dysfunktion^{2,3 ,4}.

Til måling af SR Ca^{2 +} release og diastolisk Ca^{2 +} fjernelse i cardiomyocytes, der er to udbredte tilgange: integriteten af NCX nuværende baseret på patch-klemme^5,6, og koffein-induceret Ca ^{2 +} pulse baseret på Ca^{2 +} fluorescens imaging^7,8,9. Den tidligere tilgang afhænger det faktum, at den Ca^{2 +} frigivet fra SR er i vid udstrækning pumpes ud af cellen af NCX. Dog, denne fremgangsmåde er begrænset af sine krav af avanceret udstyr og dygtige drift. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi en praktisk tilgang til at vurdere SR Ca^{2 +} reserve og Ca^{2 +} fjernelse i myocytes ved at måle en koffein-induceret Ca^{2 +} pulse baseret på en Ca^{2 +} fluorescens imaging system. Kort, intracellulære Ca^{2 +} Fluorescens er indiceret ved Fura-2. Ved en sammenknytning af stimulation system og perfusion, præsenterer vi et program for skifter perfusion og pacing system automatisk. 10 mM koffein var ansat til hurtigt inducerer samlede Ca^{2 +} udgivelse i SR. Eksponentiel henfald tid konstanter (Tau) af calcium transienter og koffein-induceret calcium pulser blev indhentet fra mono-eksponentiel kurve montering, som afspejler SERCA og NCX bidrag til diastolisk Ca^{2 +} fjernelse i overensstemmelse hermed.

Protocol

alle dyreforsøg blev udført efter protokoller godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på eksperimentelle Research Center, Kina kinesisk medicinsk akademi og Zhejiang University. 1. løsning forberedelse forberede alle løsninger, som beskrevet i tabel 1. 2. isolation af venstre ventrikel (LV) Cardiomyocytes NOTE: LV cardiomyocytes er isoleret enzymatisk ved hjælp af en Langendroff pe…

Representative Results

Her, vi illustrere streptozotocin (STZ) – induceret diabetisk rotter (DM) og alder-matchede Sprague – Dawley (SD) rotter f.eks. 8-uge-forhenværende mandlige SD rotter (200 ± 20 g) modtaget en enkelt intraperitoneal injektion af STZ (70 mg/kg, ip) til DM gruppe eller citrat buffer for kontrolgruppen. Én uge efter administration af STZ rotter med blodglukose > 16,7 mmol/L blev anset for diabetisk. Efter 8 uger blev LV myocytes enzymatisk isoleret. Efter calcium genindsætning er der …

Discussion

Calcium flux frigivet fra SR er den største Ca^{2 +} kilde for systole i hjertet. Til nogle omfang, amplitude af SR Ca^{2 +} indhold og fraktioneret Ca afspejler^{2 +} frigivet fra SR den SR Ca^{2 +} reserve tilgængelige for hjertets sammentrækning. På den anden side afhænger Ca^{2 +} reserven af SR af SR Ca^{2 +} reuptake, Ca^{2 +} lækage af SR og deres balance evne på tværs af SR under diastolen^12,13</su…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436