Beoordeling van Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve en intracellulaire diastolische Calcium verwijdering in geïsoleerde ventriculaire Cardiomyocytes

Summary

Recycling van intracellulair calcium speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes. Hier beschrijven we een protocol om te evalueren van sarcoplasmic reticulum Ca^{2 +} reserve en diastolische calcium functie voor het verwijderen in cardiomyocytes door een calcium imaging systeem.

Abstract

Recycling van intracellulair calcium speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes. Cardiale sarcoplasmic reticulum (SR) fungeert als een Ca^{2 +} reservoir voor contractie, welke reuptakes intracellulaire Ca^{2 +} tijdens ontspanning. De SR Ca^{2 +} reserve beschikbaar voor beats is bepalen voor cardiale contractibility, en de verwijdering van intracellulaire Ca^{2 +} is essentieel voor de diastolische hartfunctie. Onder sommige pathofysiologische aandoeningen, zoals diabetes en hartfalen, kunnen verminderde calcium mijnen en SR Ca^{2 +} winkel in cardiomyocytes worden betrokken in de voortgang van cardiale dysfunctie. Hier beschrijven we een protocol om SRCa^{2 +} reserve en diastolische Ca^{2 +} verwijdering te evalueren. Kortom, een enkele cardiomyocyte werd enzymatisch geïsoleerd en de intracellulaire Ca^{2 +} fluorescentie aangegeven door Fura-2 werd opgenomen door een calcium imaging systeem. Gebruiken cafeïne voor inducerende totale SR Ca^{2 +} release, vooraf wij een automatische perfusie schakelaar programma interlinking het stimulatie en de perfusie-systeem. De mono-exponentiële curve-fitting werd vervolgens gebruikt voor het analyseren van verval tijd constanten van calcium Transiënten- en cafeïne-geïnduceerde calcium peulvruchten. Dienovereenkomstig, de bijdrage van de SR Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) en Na⁺-Ca^{2 +} exchanger (NCX) te verwijderen van de diastolische calcium werd geëvalueerd.

Introduction

Intracellulair calcium ([Ca^{2 +}]_ik) recycling speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes¹. Zoals we weten, initieert de calcium-geïnduceerde Ca^{2 +} release de excitatie-contractie koppeling, die vertalen het elektrische signaal naar contractie. Membraan depolarisatie activeert de sarcolemmal L-type Ca^{2 +} kanalen, die ertoe Ca^{2 bewegen +} van de SR in het cytoplasma via ryanodine receptoren 2 (RyR2 vrijwaart). De tijdelijke verhoogde cytoplasmatische Ca^{2 +} initieert samentrekking van myofibrils. Tijdens de diastole, cytoplasmatische Ca^{2 +} is reuptaken in de SR door middel van de SR Ca^{2 +}-ATPase 2 (SERCA2) en gepompt uit de cardiomyocyte via de nb⁺-Ca^{2 +} exchanger (NCX)². Dit proces leidt tot contractie-ontspanning recycling in de cardiomyocyte.

De cardiale SR is een netwerk van intracellulaire membraan dat de contractiele machines omringt. Het fungeert als een Ca^{2 +} reservoir voor contractie, en het reabsorbs intracellulaire Ca^{2 +} tijdens ontspanning. De SR Ca^{2 +} reserve beschikbaar voor beats is bepalen voor cardiale contractility. Ondertussen, de verwijdering van intracellulaire Ca^{2 +} is essentieel voor cardiale diastole. Sommige pathofysiologische omstandigheden, zoals diabetes en hartfalen, verminderde Ca^{2 +} inklaring en depressief SR Ca^{2 +} kan winkel in cardiomyocytes worden betrokken in het proces van cardiale dysfunctie^{2,3 ,4}.

Voor het meten van SR Ca^{2 +} release en diastolische Ca^{2 +} verwijdering in cardiomyocytes, er zijn twee veelgebruikte methoden: de integriteit van de NCX huidige gebaseerd op patch-clamp^5,6, en de cafeïne-geïnduceerde Ca ^{2 +} pulse gebaseerd op Ca^{2 +} fluorescentie imaging^7,8,9. De voormalige aanpak hangt af van het feit dat de Ca^{2 +} vrijgelaten uit de Slowaakse Republiek grotendeels uit de cel door NCX gepompt is. Deze aanpak wordt echter beperkt door de eis van geavanceerde apparatuur en bekwame bediening. In de huidige studie beschrijven we een handige aanpak om te beoordelen van SR Ca^{2 +} reserve en Ca^{2 +} verwijdering in myocytes door het meten van een cafeïne-geïnduceerde Ca^{2 +} puls op basis van een Ca^{2 +} fluorescentie imaging systeem. Kort, intracellulaire Ca^{2 +} fluorescentie wordt aangegeven door Fura-2. Door koppeling van de stimulatie systeem en perfusie systeem, presenteren we een programma voor het schakelen van de perfusie en pacing systeem automatisch. 10 mM cafeïne werkte te snel bewegen totaal Ca^{2 +} release in de SR. De exponentiële afname tijd-constanten zijn (Tau) van calcium Transiënten- en cafeïne-geïnduceerde calcium peulvruchten zijn verkregen van mono-exponentiële curve passend, die de bijdrage van de SERCA en NCX aan diastolische Ca^{2 +} verwijdering dienovereenkomstig weerspiegelen.

Protocol

alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité bij experimentele Research Center, China Chinese medische academie en Zhejiang Universiteit. 1. bereiding van de oplossing bereiden alle oplossingen zoals beschreven in tabel 1. 2. isolatie van links ventriculaire (LV) Cardiomyocytes Opmerking: LV cardiomyocytes zijn geïsolee…

Representative Results

Hier, we illustreren streptozotocin (STZ) – geïnduceerde diabetesratten (DM) en leeftijd-matched Sprague – Dawley (SD) ratten bijvoorbeeld. 8-week-oude mannelijke SD ratten (200 ± 20 g) ontving een enkele intraperitoneale injectie van STZ (70 mg/kg, ip) voor de DM groep of citraat buffer voor de controlegroep. Een week na toediening van de STZ, ratten met bloedglucose > 16.7 mmol/L diabetische werden beschouwd. Na 8 weken werden de LV myocytes enzymatisch geïsoleerd. Na de herintro…

Discussion

Calcium flux vrijgelaten uit de SR is de belangrijke Ca^{2 +} bron voor systole in het hart. Zekere hoogte, de amplitude van SR Ca^{2 +} inhoud en de fractionele Ca weerspiegelen^{2 +} vrijgelaten uit de SR de SR Ca^{2 +} reserve beschikbaar voor cardiale contractie. Aan de andere kant, hangt de Ca^{2 +} reserve voor SR af van het vermogen van SR Ca^{2 +} reuptake, Ca^{2 +} lekken van SR en hun balans over de SR tijdens de diastole^12,</s…

Materials

NaCl	Alfa Aesar	E31K43
MgCl2	Alfa Aesar	I02T070
KCl	Alfa Aesar	G22u018
HEPEs	Sigma	SLBM 7880V
D-Glucose	Alfa Aesar	10189341
NaOH	Alfa Aesar	10154048
KOH	Alfa Aesar	10144B17
KH2PO4	Alfa Aesar	F21S033
MgSO4	Alfa Aesar	C31U038
L-Glutamic	Alfa Aesar	10149849
Taurine	Alfa Aesar	J5407a
EGTA	Sigma	SLBM6826V
Collagenase A	Roche	10103586001
Collagenase Type II	Worthington	45k16005
BSA	Roche	735094
caffeine	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscope	Olympus	Olympus IX 71
Langendorff system	Beijing Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipulator	Marchauser	MM33 links
Perfusion chamber	IonOptix	FHD
Valve Controlled Gravity Perfusion System	ALA	VC 3-8
valve commander software	ALA	VC 3 1.0.1.2
Precision flow regulator	Delta Med	3204315
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Micron Removable Tip	AutoMate Scientific	360um i.d.
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems	IonOptix	Hyperswitch
Recording software	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimulator	IonOptix	MyoPacer EP
Sprague-dawley rats	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436