Recycling van intracellulair calcium speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes. Hier beschrijven we een protocol om te evalueren van sarcoplasmic reticulum Ca2 + reserve en diastolische calcium functie voor het verwijderen in cardiomyocytes door een calcium imaging systeem.
Recycling van intracellulair calcium speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes. Cardiale sarcoplasmic reticulum (SR) fungeert als een Ca2 + reservoir voor contractie, welke reuptakes intracellulaire Ca2 + tijdens ontspanning. De SR Ca2 + reserve beschikbaar voor beats is bepalen voor cardiale contractibility, en de verwijdering van intracellulaire Ca2 + is essentieel voor de diastolische hartfunctie. Onder sommige pathofysiologische aandoeningen, zoals diabetes en hartfalen, kunnen verminderde calcium mijnen en SR Ca2 + winkel in cardiomyocytes worden betrokken in de voortgang van cardiale dysfunctie. Hier beschrijven we een protocol om SRCa2 + reserve en diastolische Ca2 + verwijdering te evalueren. Kortom, een enkele cardiomyocyte werd enzymatisch geïsoleerd en de intracellulaire Ca2 + fluorescentie aangegeven door Fura-2 werd opgenomen door een calcium imaging systeem. Gebruiken cafeïne voor inducerende totale SR Ca2 + release, vooraf wij een automatische perfusie schakelaar programma interlinking het stimulatie en de perfusie-systeem. De mono-exponentiële curve-fitting werd vervolgens gebruikt voor het analyseren van verval tijd constanten van calcium Transiënten- en cafeïne-geïnduceerde calcium peulvruchten. Dienovereenkomstig, de bijdrage van de SR Ca2 +-ATPase (SERCA) en Na+-Ca2 + exchanger (NCX) te verwijderen van de diastolische calcium werd geëvalueerd.
Intracellulair calcium ([Ca2 +]ik) recycling speelt een cruciale rol in de regulering van de systolische en diastolische functie in cardiomyocytes1. Zoals we weten, initieert de calcium-geïnduceerde Ca2 + release de excitatie-contractie koppeling, die vertalen het elektrische signaal naar contractie. Membraan depolarisatie activeert de sarcolemmal L-type Ca2 + kanalen, die ertoe Ca2 bewegen + van de SR in het cytoplasma via ryanodine receptoren 2 (RyR2 vrijwaart). De tijdelijke verhoogde cytoplasmatische Ca2 + initieert samentrekking van myofibrils. Tijdens de diastole, cytoplasmatische Ca2 + is reuptaken in de SR door middel van de SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) en gepompt uit de cardiomyocyte via de nb+-Ca2 + exchanger (NCX)2. Dit proces leidt tot contractie-ontspanning recycling in de cardiomyocyte.
De cardiale SR is een netwerk van intracellulaire membraan dat de contractiele machines omringt. Het fungeert als een Ca2 + reservoir voor contractie, en het reabsorbs intracellulaire Ca2 + tijdens ontspanning. De SR Ca2 + reserve beschikbaar voor beats is bepalen voor cardiale contractility. Ondertussen, de verwijdering van intracellulaire Ca2 + is essentieel voor cardiale diastole. Sommige pathofysiologische omstandigheden, zoals diabetes en hartfalen, verminderde Ca2 + inklaring en depressief SR Ca2 + kan winkel in cardiomyocytes worden betrokken in het proces van cardiale dysfunctie2,3 ,4.
Voor het meten van SR Ca2 + release en diastolische Ca2 + verwijdering in cardiomyocytes, er zijn twee veelgebruikte methoden: de integriteit van de NCX huidige gebaseerd op patch-clamp5,6, en de cafeïne-geïnduceerde Ca 2 + pulse gebaseerd op Ca2 + fluorescentie imaging7,8,9. De voormalige aanpak hangt af van het feit dat de Ca2 + vrijgelaten uit de Slowaakse Republiek grotendeels uit de cel door NCX gepompt is. Deze aanpak wordt echter beperkt door de eis van geavanceerde apparatuur en bekwame bediening. In de huidige studie beschrijven we een handige aanpak om te beoordelen van SR Ca2 + reserve en Ca2 + verwijdering in myocytes door het meten van een cafeïne-geïnduceerde Ca2 + puls op basis van een Ca2 + fluorescentie imaging systeem. Kort, intracellulaire Ca2 + fluorescentie wordt aangegeven door Fura-2. Door koppeling van de stimulatie systeem en perfusie systeem, presenteren we een programma voor het schakelen van de perfusie en pacing systeem automatisch. 10 mM cafeïne werkte te snel bewegen totaal Ca2 + release in de SR. De exponentiële afname tijd-constanten zijn (Tau) van calcium Transiënten- en cafeïne-geïnduceerde calcium peulvruchten zijn verkregen van mono-exponentiële curve passend, die de bijdrage van de SERCA en NCX aan diastolische Ca2 + verwijdering dienovereenkomstig weerspiegelen.
Calcium flux vrijgelaten uit de SR is de belangrijke Ca2 + bron voor systole in het hart. Zekere hoogte, de amplitude van SR Ca2 + inhoud en de fractionele Ca weerspiegelen2 + vrijgelaten uit de SR de SR Ca2 + reserve beschikbaar voor cardiale contractie. Aan de andere kant, hangt de Ca2 + reserve voor SR af van het vermogen van SR Ca2 + reuptake, Ca2 + lekken van SR en hun balans over de SR tijdens de diastole12,</s…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), de medische en Health Science programma van de provincie Zhejiang (nr. 201646246, Dongwu Lai), en de wetenschap van de gezondheid en Plan van de technologie van Hangzhou City (nr. 2013A28, Ding Lin).
NaCl | Alfa Aesar | E31K43 | |
MgCl2 | Alfa Aesar | I02T070 | |
KCl | Alfa Aesar | G22u018 | |
HEPEs | Sigma | SLBM 7880V | |
D-Glucose | Alfa Aesar | 10189341 | |
NaOH | Alfa Aesar | 10154048 | |
KOH | Alfa Aesar | 10144B17 | |
KH2PO4 | Alfa Aesar | F21S033 | |
MgSO4 | Alfa Aesar | C31U038 | |
L-Glutamic | Alfa Aesar | 10149849 | |
Taurine | Alfa Aesar | J5407a | |
EGTA | Sigma | SLBM6826V | |
Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
Collagenase Type II | Worthington | 45k16005 | |
BSA | Roche | 735094 | |
caffeine | Sigma | C0750 | |
Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |