Sarcoplasmic retikulum kalsiyum koruma ve hücre içi diyastolik kalsiyum kaldırma izole Ventriküler Cardiomyocytes olarak değerlendirilmesi
Summary
Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Burada, sarcoplasmic retikulum Ca2 + rezerv ve diyastolik kalsiyum kaldırma cardiomyocytes işlevinde bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından değerlendirmek için bir protokol açıklayın.
Abstract
Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Kardiyak sarcoplasmic retikulum (SR) kasılma, hangi reuptakes intrasellüler Ca2 + dinlenme sırasında için bir Ca2 + rezervuar olarak hizmet vermektedir. SR Ca2 + rezerv tempolar için kullanılabilir için kardiyak contractibility belirli ve intrasellüler Ca2 + kaldırılması kardiyak diyastolik fonksiyonları için önemlidir. Şeker hastalığı ve kalp yetmezliği gibi patofizyolojik bazı koşullar altında Engelli kalsiyum Gümrükleme ve SR Ca2 + cardiomyocytes deposunda kardiyak Disfonksiyonun sürüyor tutulabilir. Burada, SRCa2 + rezerv ve diyastolik Ca2 + kaldırma değerlendirmek için bir protokol açıklayın. Kısaca, bir tek cardiomyocyte enzimatik izole edildi ve Fura-2 tarafından belirtilen hücre içi Ca2 + floresan bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından kaydedildi. Kafein toplam SR Ca2 + yayın inducing için istihdam için biz stimülasyon ve perfüzyon sistemleri bağlantı tarafından bir otomatik perfüzyon geçiş programı önceden. O zaman, mono-üstel eğri uydurma çürüme zamanı sabitleri kalsiyum geçişler ve kafein kaynaklı kalsiyum bakliyat analiz etmek için kullanıldı. Buna göre katkısını SR Ca2 +-ATPaz (SERCA) ve Na+-Ca2 + Eşanjör (NCX) diyastolik kalsiyum kaldırma için değerlendirilir.
Introduction
Hücre içi kalsiyum ([Ca2 +]ben) geri dönüşüm cardiomyocytes1sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Bildiğimiz gibi kalsiyum kaynaklı Ca2 + yayın hangi kasılma için elektrik sinyali çevirmek kaplin, uyarma daralma başlatır. Membran depolarizasyon neden Ca2 + 2 + kanal SR ryanodine reseptörleri 2 (RyR2) yolu ile sitoplazma içine serbest bırakmak sarcolemmal L tipi Ca etkinleştirir. Geçici yükseltilmiş sitoplazmik Ca2 + myofibrils daralma başlatır. Diastole sırasında olduğunu sitoplazmik Ca2 + reuptaken içine aracılığıyla SR Ca2 +SR-ATPaz 2 (SERCA2) ve cardiomyocyteNa+-Ca 2 + Eşanjör (NCX)2üzerinden dışarı pompalanır. Bu işlem kasılma-gevşeme içinde cardiomyocyte geri dönüşüm yol açar.
Kardiyak SR contractile makine çevreleyen bir hücre içi membran ağıdır. Bu kasılma için bir Ca2 + rezervuar olarak hizmet vermektedir ve intrasellüler Ca2 + dinlenme sırasında reabsorbs. SR Ca2 + rezerv tempolar için kullanılabilir için kardiyak contractility belirli. Bu arada, intrasellüler Ca2 + kaldırılması için kardiyak diastole önemlidir. Patofizyolojik bazı koşullarda, şeker hastalığı ve kalp yetmezliği, Engelli Ca2 + izni ve depresif SR Ca2 + gibi cardiomyocytes deposunda kardiyak Disfonksiyonun2sürecinde,3 tutulabilir ,4.
SR Ca2 + yayın ve diyastolik Ca2 + kaldırılmasına cardiomyocytes ölçmek için yaygın olarak kullanılan iki yaklaşım vardır: NCX geçerli bütünlüğünü dayalı yama-kelepçe5,6ve kafein kaynaklı Ca CA2 + Floresans görüntüleme7,8,9tarihinde dayalı 2 + darbe. Eski yaklaşım SR yayımlanan Ca2 + büyük ölçüde hücreden NCX tarafından pompalanır ki aslında bağlıdır. Ancak, bu yaklaşım onun şartı gelişmiş ekipman ve usta işlemi tarafından sınırlıdır. Bu da çalışmanın, SR Ca2 + rezerv ve Ca2 + miyositler kaldırılmasına bir Ca2 + Floresans görüntüleme sistemine dayalı bir kafein kaynaklı Ca2 + darbe ölçerek değerlendirmek için uygun bir yaklaşım açıklar. Kısaca, intrasellüler Ca2 + Floresans Fura-2 tarafından belirtilir. Stimülasyon sistemi ve perfüzyon sistemi tarafından ilişkilendirerek, perfüzyon anahtarlama ve sistem otomatik olarak pacing için bir program mevcut. 10 mM kafein hızla toplam Ca2 + sürümde SR. ikna etmek için istihdam edildi Kalsiyum geçişler ve kafein kaynaklı kalsiyum bakliyat üstel çürüme zamanı sabitleri (Tau) mono üstel eğri uydurma, diyastolik Ca2 + kaldırma SERCA ve NCX katkısı uygun şekilde yansıtan elde edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kalsiyum akı SR yayımlanan başlıca Ca2 + Sistol kalbinde için kaynağıdır. Bir ölçüde, SR Ca2 + içerik genliği ve kesirli Ca SR yayımlanan2 + yansıtmak SR Ca2 + rezerv kardiyak kasılma için kullanılabilir. Öte yandan, Ca2 + rezerv SR sırasında diastole12,13,14arasında SR SR Ca2 + geri alım, Ca2 + sızıntı SR ve kendi dengesini ye…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe Çin Ulusal doğal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (No 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), tıp ve Sağlık Bilimleri programı, Zhejiang eyaleti (No 201646246, Dongwu Lai) ve Sağlık Bilimleri ve Hangzhou City (No. 2013A28, Ding Lin) teknoloji planı.
Materials
| NaCl | Alfa Aesar | E31K43 | |
| MgCl2 | Alfa Aesar | I02T070 | |
| KCl | Alfa Aesar | G22u018 | |
| HEPEs | Sigma | SLBM 7880V | |
| D-Glucose | Alfa Aesar | 10189341 | |
| NaOH | Alfa Aesar | 10154048 | |
| KOH | Alfa Aesar | 10144B17 | |
| KH2PO4 | Alfa Aesar | F21S033 | |
| MgSO4 | Alfa Aesar | C31U038 | |
| L-Glutamic | Alfa Aesar | 10149849 | |
| Taurine | Alfa Aesar | J5407a | |
| EGTA | Sigma | SLBM6826V | |
| Collagenase A | Roche | 10103586001 | |
| Collagenase Type II | Worthington | 45k16005 | |
| BSA | Roche | 735094 | |
| caffeine | Sigma | C0750 | |
| Fura-2 AM | Invitrogen | F1201 | |
| Microscope | Olympus | Olympus IX 71 | |
| Langendorff system | Beijing Syutime Technology Co | PlexiThermo-S-LANGC | |
| Micromanipulator | Marchauser | MM33 links | |
| Perfusion chamber | IonOptix | FHD | |
| Valve Controlled Gravity Perfusion System | ALA | VC 3-8 | |
| valve commander software | ALA | VC 3 1.0.1.2 | |
| Precision flow regulator | Delta Med | 3204315 | |
| Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil | AutoMate Scientific | 04-08-[360] | |
| Micron Removable Tip | AutoMate Scientific | 360um i.d. | |
| Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems | IonOptix | Hyperswitch | |
| Recording software | IonOptix | IonWizard 6.2.59 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| Sprague-dawley rats | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. | SCXK 2016-01-007436 |
References
- Capel, R. A., Terrar, D. A. The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat. Front Physiol. 6, 80 (2015).
- Bers, D. M. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).
- Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy. Cardiovasc Diabetol. 13, 75 (2014).
- Pereira, L., et al. Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes. Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).
- Coppini, R., et al. Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy. Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).
- Ferrantini, C., et al. R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility. J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).
- Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects. Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).
- Cheng, J., et al. CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).
- Lai, D., et al. The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling. J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).
- Lai, D., et al. Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKIIδ Knockout Mouse Ventricular Myocytes. J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).
- Xu, L., et al. Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice. Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).
- Roussel, J., et al. Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase. Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).
- Yaras, N., et al. Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart. Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).
- Hu, Y., et al. Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart. Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).
