تطوير هبسك المصل المشتقة الهيئات إمبريويد الحرة لاستجواب الثقافات الخلايا الجذعية 3-D باستخدام الفحوصات ذات الصلة فسيولوجيا
Summary
نحن هنا تقرير بروتوكول لتطوير نظام ثلاثي الأبعاد (3-D) من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (هيبسس) يسمى الجسم الجنين الحرة المصل (سفيب). ويمكن استخدام هذا النموذج 3-D مثل ثقافة شريحة عضوي النمط لنمذجة التنمية القشرية البشرية والاستجواب الفسيولوجي لتطوير الدوائر العصبية.
Abstract
على الرغم من أن عددا من نماذج المرض في المختبر تم تطويرها باستخدام هيبسس، أحد القيود هو أن هذه النظم ثنائية الأبعاد (2-D) قد لا تمثل الهندسة المعمارية الأساسية والتعقيد الوظيفي من الأفراد المتضررين الذين يحملون متغيرات الأمراض المشتبه بها. التقليدية 2-D نماذج تبقى تمثيلات غير مكتملة في الجسم الحي تشبه الهياكل ولا تعبر بشكل كاف عن تعقيد الدماغ. وهكذا، هناك حاجة ناشئة لمزيد من النماذج 3-D هيبسك القائمة التي يمكن أن تلخص بشكل أفضل التفاعلات الخلوية وظائف ينظر في نظام في الجسم الحي .
هنا نحن تقرير بروتوكول لتطوير نظام 3-D من هبسس غير متمايزة على أساس الجسم الجنين الحرة المصل (سفيب). هذا النموذج 3-D يعكس جوانب تطور القشرة المخية الجديدة البطينية ويسمح للدراسات في وظائف لا يتجزأ من الخلايا العصبية الحية وأنسجة سليمة مثل الهجرة والاتصال والتواصل، وحصيرةuration. على وجه التحديد، ونحن نبرهن على أن سفيبس باستخدام بروتوكول لدينا يمكن استجوابه باستخدام الفسيولوجية ذات الصلة والمحتوى عالية الخلية المقايسات القائمة مثل التصوير الكالسيوم، والتسجيلات متعددة القطب (ميي) التسجيلات دون كريوسكتيونينغ. في حالة التسجيلات ميي، ونحن نبرهن على أن سفيبس زيادة كل من ارتفاع النشاط والنشاط على مستوى الشبكة انفجار خلال زراعة على المدى الطويل. يوفر هذا البروتوكول سفيب نظام قوي وقابلة للتطوير لدراسة تطوير تشكيل الشبكة في نموذج 3-D الذي يلتقط جوانب التنمية القشرية في وقت مبكر.
Introduction
لقد سبق أن أبلغنا عن نظام نموذج ثلاثي الأبعاد، تم إنشاؤه من الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة من قبل الإنسان (هبسس) التي تلخص بعض جوانب تطوير الشبكة القشرية في وقت مبكر 1 . هذا النموذج 3-D، وهي هيئة أجنة خالية من المصل (سفيب)، ويحسن على نماذج هيبسك التجميع بسيطة السابقة 2 ، 3 . وهناك مجموعة متزايدة من العمل تكشف عن أن الهياكل 3-D مثل سفيبس لدينا، والجوانب التقريبية للتنمية العصبية التي لوحظت عادة في الجسم الحي وفي وقت سابق نقطة من لوحظ في 2-الأبعاد (2-D) / أحادي الطبقة نماذج هيبسك 4 ، 5 . وقد ركزت الدراسات الأولية على التعقيد التنظيم الذاتي للهيئات 3-D دون إظهار تعقيدها الفسيولوجية 2 .
وقد تم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا على هيبس غير متمايزة المستمدة من الخلايا الليفية و خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (بمكس). يتم الحفاظ على هذه الخلايا على γ المشعاعات الماوس الجنينية المشع (ميفس). يتم تنظيف هذه المستعمرات هيبسك يدويا من خلايا متباينة عفوية، حصاد إنزيميا، ومعلق في المتوسطة التي تحتوي على رو-كيناز المانع Y-27632 (روكي). تخضع هبسس غير المتمايزة للتفكك والطرد المركزي قبل أن يتم نقلها إلى 96 جيدا لوحات التصاق منخفضة الخامس أسفل. بعد الطلاء، يبدأ الحث العصبي باستخدام تثبيط سماد المزدوج (SB431542 و LDN193189 جنبا إلى جنب مع ديكوب 1 (دك-1)) لدفع الأمامي الأمامي الجبهي الدماغ العصبي مصير النسب 6 . بعد 14 يوما، يتم نقل سفيبس إلى إدراج ثقافة الخلية في لوحة 6 جيدا. وبمجرد نقلها، تبدأ سفيبس الجولة في الانتشار ورقيقة، مع الحفاظ على اتصالات الشبكة المحلية كما هو الحال في كثير من الأحيان لوحظ في الاستعدادات زراعة شريحة عضوي الشكل الحصين باستخدام إدخال خلية ثقافة مماثلة 1 ،سس = "كريف"> 7.
استخدام منصة سفيب 3-D على أساس هذا الشكل هو قابل للإنتاج الفعال للشبكات القشرية التي يمكن استجوابها باستخدام المقايسات الفسيولوجية الخلية القائمة مثل التصوير الكالسيوم أو المقايسات الكهربية مثل تسجيلات خلية واحدة أو مجموعة متعددة القطب (ميي ) 1 – على الرغم من أن نظم 3-D تحمل علامات التنمية القشرية في وقت مبكر، وقد أظهرت دراسات أخرى أن هذه الهيئات 3-D قد تتطلب أوقات حضانة أطول للسماح للبطء بطبيعتها وتيرة تطوير الأنسجة البشرية 8 . هذا البروتوكول سفيب يولد بنجاح 3-D سفيبس من هبسس غير المتمايزة التي تلتقط جوانب التنمية في وقت مبكر من القشرة.
إمكانات سفيبس لنماذج نموذجية الانحرافات في الاضطرابات العصبية هو قوة هذا النظام. و هيبسس المستمدة من أنسجة المريض يمكن أن تزرع في خلايا الجهاز العصبي التي تخضع للحمارأيس المتعلقة بيولوجيا الخلية وكذلك ما يصاحب ذلك التعبير الجيني. وتستخدم إيبسس الإنسان للتأكد من الملف الجيني من مجموعات كبيرة من الأفراد الذين يعانون من اضطرابات عصبية متفاوتة مع مسببات معقدة مثل اضطراب طيف التوحد (أسد)، الفصام 9 ، متلازمة ريت 10 ، ومرض الزهايمر 11 ، 12 . حتى وقت قريب، كانت نماذج إبسك عادة أحادي الطبقة الاستعدادات التي، في حين يتقن في تقييم التفاعلات الجزيئية، كانت غير كافية في فك رموز التفاعلات الخلوية المعقدة ينظر في الجسم الحي . وكانت النماذج الحيوانية البديل الافتراضي لإعادة إنشاء منصة الجهاز كله. وتعاني هذه النماذج الحيوانية من سوء ترجمة النتائج ولها قدرة محدودة على تكرار التشكيلات الجينية البشرية التي حددتها الدراسات الفحوصات الجينية الكبيرة. وهكذا، فإن تطوير نظم 3-D من إيبسس يضيف طبقة اللازمة من التعقيد في الإنساننمذجة المرض 13 ، 14 . الخطوة التالية لمنصات هيبسك 3D هو لاستيعاب متطلبات على نطاق واسع من فحص الإنتاجية العالية باستخدام فحوصات الخلية القائمة 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوفر شروط لتمييز مصدر هيبسك في هيكل 3-D الذي يلخص مرحلة تنموية في وقت مبكر من القشرة الأمامية. هذا الإجراء يعطي الهياكل التي يمكن استجوابه لالكهربية في حين يجري أيضا قابلة للمجهر. التشكل النهائي لل سفيب يشبه ذلك من عضوي النمط الثقافات شريحة الدما…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر إليزابيث بينيفيدس على التدقيق في هذه المقالة. نشكر درس. جون حسين وجين بلات لمناقشاتهم المفيدة وتعليقاتهم.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
Referências
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer’s disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer’s research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer’s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson’s Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
