Разработка HiPSC-продуцированных сывороточных свободных эмбриоидных тел для опроса трехмерных культур стволовых клеток с использованием физиологически релевантных анализов
Summary
Здесь мы сообщаем протокол о разработке трехмерной (трехмерной) системы из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), называемых свободным от сыворотки эмбриоидным телом (SFEB). Эта трехмерная модель может быть использована как органотипическая культура срезов для моделирования развития коры человека и физиологического опроса развивающихся нейронных цепей.
Abstract
Хотя ряд моделей in vitro- заболеваний был разработан с использованием hiPSCs, одно из ограничений заключается в том, что эти двумерные (двумерные) системы не могут представлять собой лежащую в основе цитоархитектурную и функциональную сложность затронутых лиц, несущих подозрительные варианты заболевания. Обычные 2-D модели остаются неполными представлениями in vivo- подобных структур и не адекватно фиксируют сложность мозга. Таким образом, появляется потребность в более трехмерных моделях на основе hiPSC, которые могут лучше повторять клеточные взаимодействия и функции, наблюдаемые в системе in vivo .
Здесь мы сообщаем протокол о разработке трехмерной системы из недифференцированных hiPSCs на основе свободного эмбриоидного тела без сыворотки (SFEB). Эта трехмерная модель отражает аспекты развивающегося вентрализованного неокортекса и позволяет изучать функции, неотъемлемые от живых нервных клеток и интактных тканей, таких как миграция, связь, связь и матгурирование. В частности, мы демонстрируем, что SFEB, использующие наш протокол, могут быть опрошены с использованием физиологически релевантных и высокоточных клеточных анализов, таких как изображения с кальцием, и записи с несколькими электродами (MEA) без криосекции. В случае MEA-записей мы демонстрируем, что SFEB увеличивают активность спайков и активность разрыва на сетевом уровне во время долгосрочного культивирования. Этот SFEB-протокол обеспечивает надежную и масштабируемую систему для изучения развития сети в трехмерной модели, которая отражает аспекты раннего развития коры.
Introduction
Ранее мы сообщали о трехмерной модельной системе, полученной из вызванных человеком человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs), которые повторяют некоторые аспекты развития ранней корковой сети 1 . Эта трехмерная модель, не содержащая сыворотки эмбриоидный корпус (SFEB), улучшает предыдущие простые агрегатные модели hiPSC 2 , 3 . Растущий объем работы показывает, что трехмерные структуры, такие как наши SFEB, приблизительные аспекты развития нервной системы, обычно наблюдаемые in vivo и в более ранние моменты времени, чем наблюдаемые в двумерных (двумерных) / монослойных hiPSC-моделях 4 , 5 . Первоначальные исследования были сосредоточены на самоорганизующейся сложности трехмерных тел без демонстрации их физиологической сложности 2 .
Протокол, описанный здесь, был использован на недифференцированных hiPSCs, полученных из фибробластов и Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС). Эти клетки поддерживаются на γ-облученных эмбриональных питателях мыши (MEFs). Эти колонии hiPSC вручную очищают от спонтанно дифференцированных клеток, ферментативно собирают и ресуспендируют в среде, содержащей ингибитор Rho-киназы Y-27632 (ROCKi). Недифференцированные hiPSCs подвергают диссоциации и центрифугированию перед переносом на 96-луночные пластины с низкой адгезией V-bottom. После гальванирования нейронную индукцию инициируют с использованием двойного ингибирования SMAD (SB431542 и LDN193189 вместе с dickkopf 1 (DKK-1)) для приведения фронта переднего фронтального переднего мозгового нейрона-судьбы 6 . Через 14 дней SFEB переносят на вставки клеточной культуры в 6-луночный планшет. После переноса круглые SFEB начинают распространяться и тонкими, сохраняя при этом местные сетевые соединения, как это часто наблюдается в гиппокампальных органотипических средах для культивирования срезов, используя аналогичные вставки 1 культуры клеток ,Ss = "xref"> 7.
Использование трехмерной платформы на основе SFEB в этом формате поддается эффективному производству корковых сетей, которые могут быть опрошены с использованием физиологических анализов на основе клеток, таких как визуализация кальция или электрофизиологические анализы, такие как записи с одной ячейкой или многоэлектродная матрица (MEA ) 1 . Хотя в трехмерных системах имеются маркеры раннего развития коры головного мозга, другие исследования показали, что эти трехмерные тела могут потребовать более длительные периоды инкубации, чтобы обеспечить по своей сути более медленные темпы развития ткани человека 8 . Этот SFEB-протокол успешно генерирует трехмерные SFEB из недифференцированных hiPSC, которые захватывают аспекты раннего развития коры.
Потенциал SFEB для моделирования сетевых аберраций при неврологических расстройствах является сильной стороной этой системы. HiPSCs, полученные из ткани пациента, могут быть выращены в клетки нервной системы, которые подлежат ослаAys, относящихся к клеточной биологии, а также сопутствующей экспрессии генов. Человеческие iPSC используются для определения генетического профиля больших групп людей с различными неврологическими расстройствами с сложными этиологиями, такими как расстройство спектра аутизма (ASD), шизофрения 9 , синдром Ретта 10 и болезнь Альцгеймера 11 , 12 . До недавнего времени iPSC-модели обычно были монослойными препаратами, которые, хотя и умели оценивать молекулярные взаимодействия, были недостаточны в расшифровке сложных клеточных взаимодействий, наблюдаемых in vivo . Модели для животных были заменой по умолчанию для воссоздания платформы всего органа. Эти модели животных страдают от плохого перевода результатов и имеют ограниченную способность копировать генетические профили человека, идентифицированные крупными генетическими скрининговыми исследованиями. Таким образом, разработка трехмерных систем из iPSC добавляет необходимый уровень сложности в человеческийМоделирование заболеваний 13 , 14 . Следующим шагом для 3D-платформ hiPSC является удовлетворение больших требований к высокопроизводительному экранированию с использованием анализа на основе клеток 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный здесь протокол обеспечивает условия для дифференциации источника hiPSC в трехмерную структуру, которая повторяет раннюю стадию развития лобной коры. Эта процедура дает структуры, которые могут быть опрошены для электрофизиологии, а также поддаются микроскопии. Окончательная…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Элизабет Беневидес за корректуру статьи. Мы благодарим доктора. Джон Гуссман и Джин Блатт за их полезные обсуждения и комментарии.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
Referências
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer’s disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer’s research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer’s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson’s Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
