פיתוח HiPSC נגזר סרום חינם גופים embryoid לחקירת 3-D תא תרבויות גזע באמצעות מבחנים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית
Summary
כאן אנו מדווחים על פרוטוקול לפתח מערכת תלת ממדית (3-D) מתאי גזע של האדם המושרה-פלוריפוטנט (hiPSCs) הנקראת גוף העובר החופשי בסרום (SFEB). מודל זה 3-D ניתן להשתמש כמו תרבות פרוסה organotypic כדי מודל התפתחות קליפת המוח האנושי ועל חקירה פיזיולוגית של פיתוח מעגלים עצביים.
Abstract
למרות שמספר מודלים של מחלות חוץ-גופית פותחו באמצעות hiPSCs, מגבלה אחת היא שמערכות דו-מימדיות אלו (2-D) אינן מייצגות את המורכבות הקיטורית והפונקציונלית הבסיסית של החולים הנגועים הנושאים גרסאות חשודות של המחלה. מודלים 2-D קונבנציונאלי להישאר ייצוגים שלמים במבנים דמויי vivo ואינם ללכוד כראוי את המורכבות של המוח. לכן, יש צורך המתעוררים יותר 3-D מודלים מבוססי hiPSC שיכולים לשחזר טוב יותר את אינטראקציות הסלולר פונקציות לראות במערכת vivo .
כאן אנו מדווחים פרוטוקול לפתח מערכת 3-D מ hiPSCs בלתי מובחנים על בסיס הגוף העובר ללא תמותה (SFEB). מודל תלת-ממדי זה משקף היבטים של ניאוקורטקס מתפתח ומאפשר מחקרים לתפקודים אינטגראליים לתאים עצביים חיים ורקמות שלמות כגון הגירה, קישוריות, תקשורת ומחצלתרוויה. באופן ספציפי, אנו מדגימים כי SFEBs באמצעות פרוטוקול שלנו ניתן לחקור באמצעות מבחני התא רלוונטיות פיזיולוגית גבוהה תוכן מבוסס כגון הדמיה סידן, ומערכות אלקטרודה רב (MEA) הקלטות ללא cryosectioning. במקרה של הקלטות MEA, אנו מראים כי SFEBs להגביר את פעילות ספייק פעילות ברמת הרשת מתפרץ במהלך תרבות לטווח ארוך. פרוטוקול SFEB זה מספק מערכת חזקה וניתנת להרחבה ללימוד פיתוח רשת במודל תלת-ממדי, אשר לוכד היבטים של התפתחות קליפת המוח.
Introduction
יש לנו בעבר דיווחו על מודל 3-D מודל, שנוצר מחולה נגזר האדם המושרה בתאי גזע pluripotent המושרה (hiPSCs) כי recapitulates כמה היבטים של פיתוח רשת קליפתית מוקדם 1 . זה מודל 3-D, גוף ללא עוברים בסרום (SFEB), משפר על מודלים פשוטים לשעבר hiPSC צבירה 2 , 3 . גוף גדל והולך של עבודה הוא חושף כי 3-D מבנים כמו SFEBs שלנו, ההיבטים המקורבים של התפתחות עצביים נפוץ נצפה in vivo ובנקודת זמן מוקדמת יותר מאשר שנצפה 2 מימדי (2-D) / monolayer hiPSC מודלים 4 , 5 . מחקרים ראשוניים כבר התמקדו המורכבות של ארגון העצמית של גופי 3-D ללא הוכחת המורכבות 2 הפיזיולוגיות שלהם.
הפרוטוקול המתואר כאן נעשה שימוש על hiPSCs מובחנים הנגזרים fibroblasts ו תאי דם מונונוגרעיניים היקפיים (PBMCs). תאים אלה נשמרים על מזוהמים עכבר מזוהמים γ (MEFs). מושבות אלה hiPSC מנוקים באופן ידני של תאים מובחנים ספונטנית, שנקטפו אנזימטית, resuspended בינוני המכיל Rho-Kinase מעכב Y-27632 (ROCKi). Uniferentiated hiPSCs נתונים דיסוציאציה ו צנטריפוגה לפני מועברים 96 נמוך נמוך הידבקות V- צלחות התחתונה. לאחר ציפוי, אינדוקציה עצבית היא יזמה באמצעות עיכוב SMAD כפול (SB431542 ו LDN193189 יחד עם dickkopf 1 (DKK-1)) לנהוג הקדמי חזיתית הקדמית forberrain neuronal- גורל השושלת 6 . לאחר 14 ימים, SFEBs מועברים מוסיף תרבות התא בצלחת 6-היטב. לאחר שהועברו, SFEBs עגול מתחילים להתפשט ודק, תוך שמירה על חיבורי הרשת המקומית כפי שנצפה לעתים קרובות בהכנות בהיפוקמפוס organotypic פרוסה תרבות באמצעות הוספת תאים דומים תרבות 1 ,Ss = "xref"> 7.
השימוש SFEB מבוסס 3-D פלטפורמת בפורמט זה מקובל הייצור היעיל של רשתות קליפת המוח, כי ניתן לחקור באמצעות מבחני פיזיולוגיים מבוססי תא כגון הדמיה סידן או מבחני אלקטרופיזי כגון הקלטות תא בודד או רב אלקטרודה מערך (MEA ) 1 . למרות 3-D מערכות לשאת את סמנים של התפתחות קליפת המוח מוקדם, מחקרים אחרים הראו כי אלה 3-D גופים עשויים לדרוש פעמים הדגירה ארוכה כדי לאפשר את קצב איטי מטבעו של התפתחות רקמת האדם 8 . זה פרוטוקול SFEB בהצלחה מייצר 3-D SFEBs מ hiPSCs לא מובחן כי לוכדת היבטים של התפתחות מוקדמת של קליפת המוח.
הפוטנציאל של SFEBs כדי מודל סטיות רשת בהפרעות נוירולוגיות הוא כוח של מערכת זו. את hiPSCs נגזר רקמת החולה ניתן לגדל לתוך התאים של מערכת העצבים כי הם כפופים התחתAys הקשורים לביולוגיה התא, כמו גם ביטוי גנטי במקביל. משתמשים ב- iPSCs כדי לבדוק את הפרופיל הגנטי של קבוצות גדולות של אנשים עם הפרעות נוירולוגיות שונות עם אטיולוגיות מורכבות כגון הפרעת ספקטרום האוטיזם (ASD), סכיזופרניה 9 , תסמונת רט, 10 ואלצהיימר 11 , 12 . עד לאחרונה, מודלים iPSC היו בדרך כלל ההכנות monolayer, כי בעוד בקיאים בהערכת אינטראקציות מולקולריות, לא היו מספיק לפענח את האינטראקציות הסלולר המורכב לראות in vivo . מודלים של בעלי חיים היו תחליף ברירת המחדל עבור מחדש את פלטפורמת האיבר כולו. מודלים אלה של בעלי חיים סובלים מתרגום גרוע של הממצאים ויש להם יכולת מוגבלת לשכפל פרופילים גנטיים אנושיים שזוהו על ידי מחקרים גדולים של בדיקות גנטיות. לפיכך, הפיתוח של מערכות תלת ממדיות מ- iPSCs מוסיף שכבה של מורכבות אנושיתדוגמנות 13 , 14 . השלב הבא עבור פלטפורמות hiPSC 3D היא להתאים את דרישות בקנה מידה גדול של הקרנה תפוקה גבוהה באמצעות מבחני תאים מבוסס 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מספק את התנאים להבדיל מקור hiPSC לתוך מבנה 3-D כי recapitulates בשלב התפתחותי מוקדם של קליפת המוח הקדמית. הליך זה מניב מבנים שניתן לחקור עבור electrophysiology בעת גם להיות מקובל למיקרוסקופ. מורפולוגיה הסופי של SFEB דומה לזו של תרבויות פרוסות המוח organotypic ומאפשר הדמיה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אליזבת Benevides להגהה את המאמר. אנו מודים לד"ר. ג 'ון Hussman ו ג' ין בלאט על דיונים מועילים שלהם הערות.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
Referências
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer’s disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer’s research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer’s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson’s Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
