生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発
Summary
ここでは、無血清胚様体（SFEB）と呼ばれるヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）から3次元（3-D）システムを開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、器質型のスライス培養のように、ヒトの皮質の発達をモデル化するため、および神経回路を発達させる生理学的な質問のために使用することができる。
Abstract
hiPSCsを使用して多数のin vitro疾患モデルが開発されているが、これらの2次元（2D）システムは、疑わしい疾患の変異を有する罹患者の基礎的な細胞構造および機能の複雑さを表さない可能性がある。従来の2次元モデルは、インビボのような構造の不完全な表現であり、脳の複雑さを適切に捕捉しない。したがって、 in vivo系で見られる細胞相互作用および機能をよりよく再現できる、より多くの3-D hiPSCベースのモデルが必要となっている。
ここでは、無血清胚様体（SFEB）に基づく未分化hiPSCからの3-D系を開発するためのプロトコールを報告する。この3-Dモデルは、発達中の腹側新皮質の局面を反映しており、泳動、接続性、通信およびマットのような生きた神経細胞およびインタクトな組織に不可欠な機能への研究を可能にする期間。具体的には、本発明者らのプロトコールを用いたSFEBは、カルシウムイメージング、および凍結切除なしの多電極アレイ（MEA）記録のような生理学的に関連した高含量細胞ベースのアッセイを用いて調べることができることを示す。 MEA記録の場合、我々はSFEBが長期間の培養中にスパイク活性およびネットワークレベル破裂活性の両方を増加させることを示す。このSFEBプロトコルは、早期皮質発達の局面を捕捉する3-Dモデルにおけるネットワーク形成の発展の研究のための堅牢でスケーラブルなシステムを提供する。
Introduction
私たちはこれまで、ヒト由来の多能性幹細胞（hiPSCs）由来の患者由来の3次元モデルシステムを報告しましたが、これは早期皮質ネットワーク開発のいくつかの側面を再現しています1 。この3-Dモデル、無血清胚様体（SFEB）は、以前の単純な集約hiPSCモデル2,3に向上します。仕事の成長体は、5 /単層hiPSCモデル4私達のSFEBsような3-D構造が、神経発生のおおよその態様は、一般的にインビボおよび2次元（2-D）で観察されるより前の時点で観察されたことが明らかにされています。初期の研究は、生理学的複雑性2を示さずに3次元物体の自己組織化の複雑さに焦点を当てている2 。
本明細書に記載のプロトコルは、線維芽細胞由来の未分化hiPSCおよび末梢血単核細胞（PBMC）である。これらの細胞はγ線照射マウス胚性フィーダー（MEFs）上で維持される。これらのhiPSCコロニーを、自然に分化した細胞を手動で洗浄し、酵素的に採取し、Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632（ROCKi）を含有する培地中に再懸濁する。未分化hiPSCを解離および遠心分離に供してから、96ウェルの低接着V底プレートに移す。プレーティング後、前頭前野前脳ニューロン運命系統6を駆動するために、二重SMAD阻害（SB431542およびdNK193189とDickkopf1（DKK-1））を用いて神経誘導を開始する。 14日後、SFEBを6ウェルプレートの細胞培養インサートに移す。一旦移されると、丸いSFEBは、同様の細胞培養インサート1を用いて海馬の器官型スライス培養物調製物でしばしば観察されるように、局所ネットワーク接続を維持しながら、広がり始め、ss = "xref"> 7。
この形式のSFEBに基づく3Dプラットフォームの使用は、カルシウムイメージングまたは電気生理学的アッセイ（例えば、単細胞記録または多電極アレイ（MEA）などの細胞ベースの生理学的アッセイを用いて調べることができる皮質ネットワークの効率的な産生に適している。 ） 1 。 3-Dシステムは早期皮質発達のマーカーを担っているが、他の研究では、これらの3-D体は本質的に遅いヒト組織発生のペースを可能にするためにより長いインキュベーション時間を必要とすることが示されている8 。このSFEBプロトコルは、皮質の初期発生の局面を捕捉する未分化hiPSCからの3-D SFEBを首尾よく生成する。
神経学的障害におけるネットワーク異常をモデル化するためのSFEBの可能性は、このシステムの強みである。患者の組織由来のhiPSCsは、お尻になる神経系の細胞に成長することができます細胞生物学および付随する遺伝子発現に関するものである。ヒトiPS細胞は、自閉症スペクトラム障害（ASD）、統合失調症9、レット症候群10、およびアルツハイマー病11、12のような複雑な病因を有する神経障害を変化させ、個人の大きなグループの遺伝子プロファイルを確認するために使用されています。最近まで、iPSCモデルは、典型的には、分子相互作用の評価に堪能ではあるが、インビボで見られる複雑な細胞相互作用を解読するには不十分な単層調製物であった。動物モデルは、全臓器プラットフォームを再現するためのデフォルトの代替物である。これらの動物モデルは、所見の翻訳の貧弱さに悩まされ、大規模な遺伝子スクリーニング研究によって同定されたヒト遺伝子プロファイルを複製する能力が限られている。従って、iPSCからの3-Dシステムの開発は、人間に必要な複雑さの層を加える疾患モデル13、14。 3D hiPSCプラットフォームの次のステップは、細胞ベースのアッセイを用いたハイスループットスクリーニングの大規模要件に対応することです15 。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載のプロトコルは、hiPSC供給源を、前頭皮質の初期発達段階を再現する3-D構造に区別するための条件を提供する。この手順は、電気生理学のために調べることができ、顕微鏡検査も受け入れやすい構造をもたらす。 SFEBの最終形態は、器官型脳スライス培養のものに似ており、高品質の詳細な共焦点イメージングを可能にする。このプロトコルは、線維芽細胞および末梢血単核細…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
記事を校正してくれたElizabeth Benevidesに感謝します。私たちはDrsに感謝します。ジョン・ハスマンとジーン・ブラットが彼らの有益な議論とコメントのために語った。
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
Referências
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