Desarrollo de cuerpos embrionarios libres de suero derivados de HiPSC para la interrogación de cultivos de células madre tridimensionales usando ensayos fisiológicamente relevantes
Summary
Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema tridimensional (3-D) de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (HiPSCs) llamado cuerpo embrioide libre de suero (SFEB). Este modelo tridimensional puede ser utilizado como un cultivo de corte organotípico para modelar el desarrollo cortical humano y para la interrogación fisiológica del desarrollo de circuitos neuronales.
Abstract
Aunque una serie de modelos de enfermedades in vitro se han desarrollado utilizando hiPSCs, una limitación es que estos sistemas bidimensionales (2-D) pueden no representar la subyacente cytoarchitectural y complejidad funcional de los individuos afectados portadores de las variantes de enfermedad sospechosos. Modelos convencionales 2-D siguen siendo incompletas representaciones de in vivo- como las estructuras y no captar adecuadamente la complejidad del cerebro. Por lo tanto, hay una necesidad emergente de más modelos basados en HiPSC 3-D que puedan recapitular mejor las interacciones y funciones celulares vistas en un sistema in vivo .
Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema 3-D de hiPSC indiferenciados basados en el cuerpo embrioide libre de suero (SFEB). Este modelo tridimensional refleja aspectos de un neocórtex ventralizado en desarrollo y permite estudiar las funciones integrales de las células neurales vivas y el tejido intacto tales como la migración, la conectividad, la comunicación y la alfombraCión. Específicamente, demostramos que los SFEBs que usan nuestro protocolo pueden ser interrogados utilizando ensayos basados en células fisiológicamente relevantes y de alto contenido como imágenes de calcio y registros de múltiples electrodos (MEA) sin criosección. En el caso de las grabaciones de MEA, demostramos que los SFEBs aumentan tanto la actividad de pico como la actividad de ruptura a nivel de la red durante el cultivo a largo plazo. Este protocolo SFEB proporciona un sistema robusto y escalable para el estudio del desarrollo de la formación de redes en un modelo tridimensional que captura aspectos del desarrollo cortical temprano.
Introduction
Hemos informado anteriormente de un sistema modelo 3D, generado a partir de pacientes derivados de las células madre pluripotentes inducidas por humanos (HiPSCs) que recapitula algunos aspectos de la primera red cortical desarrollo 1 . Este modelo tridimensional, un cuerpo embrionario libre de suero (SFEB), mejora los modelos hiPSC anteriores de agregación simple 2 , 3 . Un creciente cuerpo de trabajo está revelando que las estructuras tridimensionales como nuestro SFEBs, los aspectos aproximados de desarrollo neural comúnmente observados in vivo y en un momento anterior de lo observado en 2-dimensional (2-D) / monolayer hiPSC modelos [ 4 , 5] . Los estudios iniciales se han centrado en la complejidad autoorganizada de los cuerpos tridimensionales sin demostrar su complejidad fisiológica 2 .
El protocolo descrito aquí se ha utilizado en los hiPSC indiferenciados derivados de fibroblastos y Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs). Estas células se mantienen en alimentadores embrionarios de ratón irradiados con γ (MEFs). Estas colonias hiPSC se limpian manualmente de células espontáneamente diferenciadas, se cosechan enzimáticamente y se resuspenden en medio que contiene el inhibidor de la Rho-quinasa Y-27632 (ROCKi). Los hiPSC indiferenciados se someten a disociación y centrifugación antes de ser transferidos a placas de fondo en V de baja adherencia de 96 pocillos. Después de la galjanoplastia, la inducción neural se inicia usando la inhibición SMAD dual (SB431542 y LDN193189 junto con dickkopf 1 (DKK-1)) para conducir un linaje neuronal-fado forebrain anterior-frontal 6 . Después de 14 días, los SFEB se transfieren a insertos de cultivo celular en una placa de 6 pocillos. Una vez transferidos, los SFEBs redondos comienzan a esparcirse y adelgazarse, manteniendo al mismo tiempo conexiones de red local como se observa a menudo en preparaciones de cultivo de corte organotípico del hipocampo usando insertos de cultivo de células similares 1 ,Ss = "xref"> 7.
El uso de una plataforma tridimensional basada en SFEB en este formato es susceptible a la producción eficiente de redes corticales que pueden ser interrogadas usando ensayos fisiológicos basados en células tales como imágenes de calcio o ensayos electrofisiológicos tales como grabaciones de célula única o matriz de múltiples electrodos (MEA ) 1 . Aunque los sistemas tridimensionales llevan los marcadores de desarrollo cortical temprano, otros estudios han demostrado que estos cuerpos 3-D pueden requerir tiempos de incubación más largos para permitir el ritmo inherentemente más lento de desarrollo de tejidos humanos 8 . Este protocolo SFEB genera con éxito los SFEB 3-D de los hiPSC indiferenciados que capturan aspectos del desarrollo temprano de la corteza.
El potencial de los SFEBs para modelar aberraciones de red en trastornos neurológicos es una fuerza de este sistema. Los hiPSCs derivados del tejido del paciente pueden crecer en células del sistema nervioso que están sujetas a culoAys relacionados con la biología celular, así como la expresión génica concomitante. Las iPSC humanas se utilizan para determinar el perfil genético de grandes grupos de individuos con diferentes trastornos neurológicos con etiologías complejas como el trastorno del espectro autista (TEA), la esquizofrenia 9 , el síndrome de Rett 10 y la enfermedad de Alzheimer 11 , 12 . Hasta hace poco, los modelos iPSC eran típicamente preparaciones monocapa que, aunque eran competentes en la evaluación de interacciones moleculares, eran inadecuadas para descifrar las interacciones celulares complejas vistas in vivo . Los modelos animales han sido el sustituto por defecto para recrear la plataforma de órgano entero. Estos modelos animales están plagados de mala traducción de los hallazgos y tienen una capacidad limitada para replicar los perfiles genéticos humanos identificados por grandes estudios de cribado genético. Por lo tanto, el desarrollo de sistemas 3-D de iPSCs añade una capa necesaria de complejidad en humanosModelación de enfermedades 13 , 14 . El siguiente paso para las plataformas 3D hiPSC es acomodar los requerimientos a gran escala de la detección de alto rendimiento mediante ensayos basados en células 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí proporciona las condiciones para diferenciar una fuente hiPSC en una estructura tridimensional que recapitula una etapa temprana de desarrollo de la corteza frontal. Este procedimiento produce estructuras que pueden ser interrogadas para electrofisiología, al tiempo que son susceptibles de microscopía. La morfología final del SFEB se asemeja a la de los cultivos organotípicos del corte cerebral y permite una imagen confocal detallada de alta calidad. Este protocolo puede generar con éxit…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a Elizabeth Benevides por corregir el artículo. Damos las gracias a los Dres. John Hussman y Gene Blatt por sus útiles discusiones y comentarios.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
Referências
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