Développer des corps embryoïdes libres de sérum dérivés dérivés de HiPSC pour l'interrogation de cultures cellulaires souches 3-D à l'aide de tests physiologiquement pertinents
Summary
Ici, nous rapportons un protocole pour développer un système tridimensionnel (3-D) à partir de cellules souches induites par l'homme-pluripotent (hiPSC) appelé le corps embryoïde sans sérum (SFEB). Ce modèle 3-D peut être utilisé comme une culture de tranche organotypique pour modéliser le développement cortical humain et pour l'interrogation physiologique des circuits neuronaux en développement.
Abstract
Bien qu'un certain nombre de modèles de maladies in vitro aient été développés à l'aide de HiPSC, une limitation est que ces systèmes bidimensionnels (2-D) peuvent ne pas représenter la complexité cytoarchitecturale et fonctionnelle sous-jacente des personnes concernées portant des variants présumés de la maladie. Les modèles 2-D classiques restent des représentations incomplètes des structures semblables à celles de l' in vivo et ne captent pas adéquatement la complexité du cerveau. Ainsi, il existe un besoin émergent de plus de modèles 3-D hiPSC qui peuvent mieux récapituler les interactions et les fonctions cellulaires observées dans un système in vivo .
Nous rapportons ici un protocole pour développer un système 3-D à partir de hiPSC non indifférenciés basé sur le corps embryoïde sans sérum (SFEB). Ce modèle 3-D reflète les aspects d'un néocortex ventralisé en développement et permet des études sur des fonctions intégrées aux cellules neuronales vivantes et aux tissus intacts tels que la migration, la connectivité, la communication et le matelasUration. Plus précisément, nous démontrons que les SFEB utilisant notre protocole peuvent être interrogés à l'aide de tests basés sur des cellules physiologiquement pertinents et à haute teneur, tels que l'imagerie au calcium et les enregistrements multi-électrodes (AMA) sans cryotypie. Dans le cas des enregistrements MEA, nous démontrons que les SFEB augmentent l'activité de pointe et l'activité d'éclatement au niveau du réseau pendant la culture à long terme. Ce protocole SFEB fournit un système robuste et évolutif pour l'étude du développement de la formation de réseau dans un modèle 3-D qui capte des aspects du développement corticale précoce.
Introduction
Nous avons déjà signalé un système modèle 3-D, généré à partir de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC), qui récapitule certains aspects du développement initial du réseau cortical 1 . Ce modèle 3-D, un corps embryoïde sans sérum (SFEB), améliore l'agrégation simple précédente hiPSC models 2 , 3 . Un travail croissant révèle que les structures en 3-D, comme nos SFEB, ont des aspects approximatifs du développement neuronal communément observés in vivo et à un point de temps antérieur à ceux observés dans les modèles 2 , 5 (2-D) / monocouches hiPSC. Les études initiales ont porté sur la complexité auto-organisée des corps en 3-D sans démontrer leur complexité physiologique 2 .
Le protocole décrit ici a été utilisé sur des hiPSC indifférenciés dérivés de fibroblastes et Cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC). Ces cellules sont maintenues sur des alimentateurs embryonnaires de souris irradiés par γ (MEF). Ces colonies hiPSC sont nettoyées manuellement de cellules spontanément différenciées, récoltées enzymatiquement et remises en suspension dans un milieu contenant l'inhibiteur de Rho-kinase Y-27632 (ROCKi). Les hiPSC indifférenciés sont soumis à la dissociation et à la centrifugation avant d'être transférés dans des plaques à fond de V à faible adhérence à 96 puits. Après le placage, l'induction neurale est initiée à l'aide d'une double inhibition de SMAD (SB431542 et LDN193189 avec dickkopf 1 (DKK-1)) pour conduire une lignée de front neuronal avant-cerveau avant antérieur 6 . Après 14 jours, les SFEB sont transférés dans des plaquettes de culture cellulaire dans une assiette à 6 puits. Une fois transféré, les SFEB rondes commencent à se propager et minces, tout en maintenant les connexions au réseau local, comme cela est souvent observé dans les préparations de culture en tranche organotypique de l'hippocampe en utilisant des inserts de culture cellulaire similaires 1 ,Ss = "xref"> 7.
L'utilisation d'une plate-forme 3D basée sur SFEB dans ce format est susceptible de produire efficacement des réseaux corticaux qui peuvent être interrogés à l'aide de tests physiologiques à base de cellules tels que l'imagerie au calcium ou des analyses électrophysiologiques telles que les enregistrements cellulaires simples ou les ensembles multi-électrodes (MEA ) 1 . Bien que les systèmes 3-D portent les marqueurs du développement corticale précoce, d'autres études ont montré que ces corps 3-D peuvent nécessiter des temps d'incubation plus longs pour permettre le rythme intrinsèquement plus lent du développement des tissus humains 8 . Ce protocole SFEB génère avec succès des SFEB 3-D à partir de hiPSC indifférenciés qui capte des aspects du développement précoce du cortex.
Le potentiel des SFEB pour modéliser les aberrations du réseau dans les troubles neurologiques est une force de ce système. Les hiPSC dérivés du tissu patient peuvent être transformés en cellules du système nerveux qui sont sujettes à un culAys concernant la biologie cellulaire ainsi que l'expression concomitante des gènes. IPSCs humaines sont utilisées pour déterminer le profil génétique de grands groupes de personnes avec divers troubles neurologiques d'étiologies complexes tels que les troubles du spectre autistique (ASD), la schizophrénie 9, le syndrome de Rett 10, et la maladie d'Alzheimer 11, 12. Jusqu'à récemment, les modèles iPSC étaient généralement des préparations monocouches qui, tout en maîtrisant l'évaluation des interactions moléculaires, étaient insuffisantes pour déchiffrer les interactions cellulaires complexes observées in vivo . Les modèles animaux ont été le substitut par défaut pour recréer la plate-forme entière d'organe. Ces modèles animaux sont en proie à une mauvaise traduction des résultats et ont une capacité limitée à reproduire les profils génétiques humains identifiés par de grandes études de dépistage génétique. Ainsi, le développement de systèmes 3-D à partir d'iPSCs ajoute une couche de complexité nécessaire en humainModélisation de la maladie 13 , 14 . La prochaine étape pour les plates-formes 3D HiPSC est de répondre aux exigences à grande échelle du dépistage à haut débit en utilisant des analyses à base de cellules 15 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici fournit les conditions pour différencier une source hiPSC en une structure 3-D qui récapitule un stade de développement précoce du cortex frontal. Cette procédure donne des structures qui peuvent être interrogées pour l'électrophysiologie tout en étant susceptibles de microscopie. La morphologie finale du SFEB ressemble à celle des cultures de tranches de cerveau organotypiques et permet une imagerie confocale détaillée de haute qualité. Ce protocole peut générer des SFEB à l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Elizabeth Benevides d'avoir révisé l'article. Nous remercions les Drs. John Hussman et Gene Blatt pour leurs discussions et commentaires utiles.
Materials
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250ml |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385ml |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100X), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5ml |
| 2-Mercaptoethanol (1,000X), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900ul |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1X), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| N-2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1X), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500ml |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50X), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10ml |
| Glutamax 200mM | Invitrogen | 35050061 | 5ml |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2uM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1000 (10uM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1uM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10uM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200ng/ml |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4uM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
Referências
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