Неинвазивный выборки слизистую жидкость для количественной оценки в Vivo иммунной посредника уровня верхних дыхательных путей
Summary
Этот протокол описывает неинвазивным методом отбора проб ненарушенных слизистую жидкость из верхних дыхательных путей. Он может использоваться для выполнения количественная оценка в естественных условиях уровни белка посредников, таких как цитокинов и chemokines, в субъектах всех возрастов.
Abstract
Этот протокол описывает неинвазивной проб жидкости слизистую ненарушенных верхних дыхательных путей. В нем также подробно процедура извлечения до анализа иммунных посредников в жидкости элюаты для изучения сократимость актуальные иммунной подписи, без необходимости для стимуляции процедур (часто используется другими методами). Слизистую жидкость пробы на прокладке фильтровальной бумаги размещены на передней части нижней носовой раковины и влево на 2 мин поглощения. Аналитов этого eluted из фильтр-бумаги, и извлеченные на основе белков элюаты анализируются на основе electrochemiluminescence иммуноанализ, позволяя высок чувствительности количественного определения низкого и высокого уровня аналитов в том же образце. Мы измерили уровни в vivo 20 предварительно иммунной посредников, связанных с конкретными иммунной, сигнальные пути в слизистую оболочку верхних дыхательных путей, но техника не ограничивается этой конкретной группы или отбора проб. Этот метод был впервые реализован в 7-год старый детей от Копенгагена перспективных исследований об астме в когорте2000 (COPSAC2000) детство с аллергическим ринитом. После этого он использовался в продольной COPSAC2010 когорта, отобранных на 1 месяц, 2 года и 6 лет и в случаях острых респираторных симптомов. Мы успешно получены и проанализированы пробы из 620 (89%), 700 детей 1-месячного; несколько образцов были ниже предела обнаружения пробирного (сообщили как медиана (межквартильный диапазон (ИКР)). Количество образцов ниже предела обнаружения (т.е. от 0 до застывания для нижнего предела обнаружения), для каждого посредника был 29 (7,25-119,5). Эта техника позволяет количественная оценка в vivo слизистой иммунной профиля дыхательных путей от рождения, могут быть применены в продольном направлении и может быть применен к исследования о влиянии генетики и Ранняя жизнь экологического воздействия, Патофизиология, endotyping и мониторинга заболеваний органов дыхания и разработки и оценки новых терапевтических средств.
Introduction
Жидкости слизистую носа составляет жидкой частью системы верхних дыхательных путей. Он состоит из сложной матрицы посредников, производный от взаимосвязи между эпителием и иммунные клетки, которые составляют первую линию обороны против вторжения микроорганизмов. Слизистой оболочки носа легко доступны, и есть сильные функциональные и иммунологические отношения между носом и бронхов1. Этот отсек имеет особый интерес по отношению к сократимость, которые являются общими в детстве, таких как астмы и аллергического ринита, но и для ряда других респираторных заболеваний, более распространена позднее в жизни.
Здесь мы описывают реализацию метода для образца ненарушенных слизистой накладки жидкости из полости носа с помощью фильтра бумажных, неинвазивный метод, а также процедура последующего извлечения, используемый для элюировать на основе белков аналитов от фильтра документов до их количественной оценки. Этот метод может например, использоваться для получения в естественных условиях иммунные подписей здоровых людей и людей с различными заболеваниями органов дыхания. Кроме того это возможно для изучения воздействия значение для конкретного иммунной подписи и оценить, если это предсказатель или посредника позднее развития болезни.
Ранее были получены слизистую жидкость промывание носа2, который часто предшествует носовой вызов тест, где Аллерген вводится в высоких уровнях для стимулирования воспалительной реакции3,4. Однако техника промывание носа не осуществима в маленьких детей и вводит неизвестного разрежения фактор, который смешивает итоги, разбавленным посредника, которую уровнях может упасть ниже предела обнаружения пробирного5. Кроме того из-за неизвестного разрежения фактор, измеренной аналита ответов от носовой бросить вызов тесты не являются сопоставимыми между людьми, тем самым ограничивая полезность техника промывание носа в когортное установка. Наконец Аллерген задача применима только к сенсибилизированных предметам, и других проблем, таких как гистамин challenge, актуальны не физиологически, потенциально вызывая эффект потолок на посредника релиза. Эти проблемы обходятся в представленных на основе Бумага фильтровальная техника для слизистую жидкость коллекции, где отдельных секреции жидкости и аналита уровни являются единственными факторами, которые влияют разница между отдельными.
Во время процедуры извлечения аналитов этого eluted из фильтр-бумаги после добавления идентичных томов буфера для всех образцов. Это способствует аналогичные ex vivo разбавления всех образцов. Извлечения буфер на основе альбумина изотонический солевой раствор используется для извлечения шага; Он включает извлечение на основе белков посредников и стабилизирует белки ограничить денатурации во время последующего замерзания eluted белков до количественной оценки. Чтобы избежать деградации белка на этапе добычи, коктейль ингибиторов протеазы добавляется в буфер добычи.
Реализация методов, которые позволяют для количественной оценки спокойно, в естественных условиях-созданных иммунных посредников на участках слизистой имеет первостепенное значение. Во-первых слизистой сайт составляет крупнейший иммунологические орган в теле. Во-вторых носовые расположение является основной сайт воздействия переносимых по воздуху и плотно подключен к дыхательной иммунологические отсек легких1. В-третьих возможность съемки этот важный орган с неинвазивный метод открывает возможность предоставить множество информации на оси важных Микроб иммунной взаимодействия в отношении здоровья и болезни в дыхательных путях. В-четвертых существует много других возможных применений этого метода, например изучение местных иммунологические изменения в рандомизированных контролируемых испытания наркотиков и микроэлементов.
Мы изначально реализован технику в Копенгагене перспективных исследований об астме в детстве когорте2000 (COPSAC2000), где мы определили иммунной профиль слизистую жидкость в 7-год старый детей с аллергическим ринитом против здорового управления13. Впоследствии мы успешно применяется этот метод продольное когортное2010 COPSAC и иммунных профили начисленных сократимость, на 1 месяц, 2 года и 6 лет и в случаях острых респираторных симптомов. Результаты 1-месяц старый новорожденных продемонстрировали важные связи между иммунной подписи и Ранняя жизнь экологического воздействия7,8,9,10,,1112.
Protocol
Representative Results
Discussion
С техникой, представленные здесь мы смогли определить в vivo верхний сократимость слизистой иммунной профиля в детей в возрасте от 1 месяца возраста, которое не было сделано ранее в кратчайшие сроки. Мы отмечает, что наличие конкретных сократимость бактерий и picornaviruses7…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем нашу признательность за их поддержку и приверженность детям и семьям COPSAC2010 когортное исследование. Мы признаем и ценим уникальный усилия COPSAC исследовательской команды и техническую помощь от техник Лизбет Буус Rosholm, технический университет Дании, для измерения цитокинов и chemokines.
Materials
| Fibrous hydroxylatedpolyester sheets | Accuwik Ultra | SPR0730 | Filter paper |
| Milliplex Assay Buffer | Millipore | L-AB | Buffer |
| low-protein binding storage plates | Thermo Scientific | CLS8161 | Plates |
| Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Reader of multi-spot plates | Mesoscale | NA | Sector imager 6000 |
| Assays | Mesoscale | Human 10-plex TH1/TH2 cytokine assay and 9-plex chemokine assay, and singleplex IL-17A, TGF-β1and TSLP. A description can be found online on www.mesoscale.com |
Referências
- Bousquet, J., van Cauwenberge, P., Khaltaev, N. Allergic Rhinitis and Its Impact on Asthma. J Allergy Clin Immunol. 108 (5), 147-334 (2001).
- Howarth, P. H., Persson, C. G. A., Meltzer, E. O., Jacobson, M. R., Durham, S. R., Silkoff, P. E. Objective monitoring of nasal airway inflammation in rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 115 (3), 414-441 (2005).
- Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88 (5), 457-462 (2002).
- Sussman, G. L., Mason, J., Compton, D., Stewart, J., Ricard, N. The efficacy and safety of fexofenadine HCl and pseudoephedrine, alone and in combination, in seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 104 (1), 100-106 (1999).
- Bisgaard, H., Robinson, C., Rømeling, F., Mygind, N., Church, M., Holgate, S. T. Leukotriene C4 and histamine in early allergic reaction in the nose. Allergy. 43 (3), 219-227 (1988).
- Chawes, B. L. K., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125 (6), 1387-1389 (2010).
- Følsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187 (6), 589-595 (2013).
- Følsgaard, N. V., et al. Neonatal Cytokine Profile in the Airway Mucosal Lining Fluid Is Skewed by Maternal Atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 275-280 (2012).
- Chawes, B. L., et al. Effect of Vitamin D3 Supplementation During Pregnancy on Risk of Persistent Wheeze in the Offspring: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 315 (4), 353-361 (2016).
- Bischoff, A. L., et al. Altered Response to A(H1N1)pnd09 Vaccination in Pregnant Women: A Single Blinded Randomized Controlled Trial. PloS One. 8 (4), 56700 (2013).
- Wolsk, H. M., et al. Picornavirus-Induced Airway Mucosa Immune Profile in Asymptomatic Neonates. J Infect Dis. 213 (8), 1262-1270 (2016).
- Wolsk, H. M., Chawes, B. L., Følsgaard, N. V., Rasmussen, M. A., Brix, S., Bisgaard, H. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71 (6), 820-828 (2016).
- Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155 (1), 25-29 (1992).
- Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29 (4), 896-898 (2001).
- Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (6), 1088-1094 (2004).
- Nakano, Y., et al. Endothelin-1 level in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Respirology. 12 (5), 740-743 (2007).
- Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease’s airways. Pulm Pharmacol Ther. 18 (4), 297-302 (2005).
- Moeller, A., Franklin, P., Hall, G. L., Horak, F., Wildhaber, J. H., Stick, S. M. Measuring exhaled breath condensates in infants. Pediatr Pulmonol. 41 (2), 184-187 (2006).
