Metoder til ekstraktion af endosymbionter fra Whitefly<em> Bemisia tabaci</em
Summary
Her præsenterer vi en protokol til isolering af endosymbionter fra whitefly Bemisia tabaci gennem dissektion og filtrering. Efter amplifikation er DNA-prøverne egnede til efterfølgende sekventering og undersøgelse af gensidigheden mellem endosymbioner og whitefly.
Abstract
Bakterie symbionter danner et intimt forhold til deres værter og giver i de fleste tilfælde fordele til værterne. Genomisk information er kritisk for at studere funktioner og evolution af bakterielle symbioner i deres vært. Da de fleste symbionter ikke kan dyrkes in vitro , er metoder til isolering af en tilstrækkelig mængde bakterier til genom-sekventering meget vigtige. I Whitefly Bemisia tabaci er der blevet identificeret en række endosymbioner, og det forudses at være af betydning for udviklingen og reproduktionen af skadedyrene gennem flere tilgange. Imidlertid forbliver den mekanisme, der ligger til grund for foreningerne, stort set ukendt. Hindringen kommer delvis fra den kendsgerning, at endosymbionterne i whitefly, der hovedsagelig er fastholdt i bakteriocytter, er svære at adskille fra værtscellerne. Her rapporteres en trin-for-trin protokol til identifikation, ekstraktion og oprensning af endosymbionter fra whitefly B. tabaci hovedsagelig ved dissectiPå og filtrering. Endosymbiont-prøver fremstillet ved denne metode, selv om de stadig er en blanding af forskellige endosymbiont-arter, er egnede til efterfølgende genomsekventering og analyse af de mulige roller af endosymbioner i B. tabaci . Denne metode kan også bruges til at isolere endosymbioner fra andre insekter.
Introduction
Bakterier der danner et intimt symbiotisk forhold med relative værter er udbredt i leddyr 1 . Endosymbionterne har vist sig at påvirke aspekter af værter, såsom ernæringsmetabolismen, reproduktion, respons på miljøbelastninger 2 , 3 , 4 etc. i næsten alle udviklingsstadier 5 . Imidlertid er mekanismen, der ligger til grund for foreningerne, stadig stort set ukendt. Genomics er af prioritet og betydning, når man studerer de potentielle funktioner og roller af bakterier. Nogle grundlæggende oplysninger, dvs. den taksonomiske status, funktionelle gener, metabolismeveje, sekretionssystemer, kan udledes af genometsekvenser, som kaster lys på symbionernes mulige roller i symbiose. Med udviklingen af høj gennemstrømningssekvensering er et stort antal bakteriegener blevet sekventeret wMed forskellige funktioner afsløret 6 .
Endosymbionter er af afgørende betydning i hæmipteraner, såsom bladlus 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , brune plantehoppere 10 og cikader 11 . For eksempel har Buchnera i bladlus, som obligatorisk symbiont, vist sig at være involveret i essentiel aminosyrebiosyntese sammen med generne fra bladlusgenomet 12 . Desuden afsløres transkriptionel regulering af Buchnera 13 . I psyllider er Carsonella sekventeret og rangeret det mindste bakteriegenomet nogensinde fundet 14 . Alle disse karakteristika for endosymbioner er baseret og udledes af genometsekvenserne. Da disse endosymbioner ikke kan dyrkes in vitro , er der blevet anvendt flere fremgangsmåder til isolering af passende bakterier til sequencing. I bladlus ekstraheres endosymbioner gennem centrifugering og filtrering og udsættes for yderligere genomisk og transkriptomisk analyse 5 . I brune plantehoppere sekvenseres endosymbioner sammen med hele insektgenomet 10 .
Whitefly B. tabaci er et artskompleks, der indeholder mere end 35 morfologisk ubestridelige arter (kryptiske arter), blandt hvilke to invasive arter har invaderet over hele verden og forårsaget en stor skade for landbrugsproduktionen 15 . Af observeret har endosymbioner inden for B. tabaci- arterne vist betydning i udviklingen af skadegørerne 16 . Til dato er otte endosymbioner blevet identificeret i whiteflyen, herunder obligate symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum og syv sekundære symbionter Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea og Hemipteriphilus defineret 17 , 18 .
I modsætning til de tidligere beskrevne hemipteraner er whitefly B. tabaci et ekstremt lille insekt kun 1 mm i længden. De fleste endosymbioner er begrænset til bakteriocytter 19 (specialiserede celler indeholdende symbionter, som yderligere danner bakteriomer i B. tabaci ). Derudover kan disse endosymbioner ikke dyrkes in vitro . Den eneste måde at opnå endosymbionter fra B. tabaci er at dissekere bakterien ud. Der er dog vanskeligheder med dissektionen. For det første forbinder den skrøbelige bakteriom altid med andre væv fra whiteflyen, hvilket er svært at adskille. For det andet begrænser den lille størrelse af whitefly isoleringen af nok bakteriomer. For det tredje slutter endosymbionter i bakteriomet, hvilket gør det ekstremt kompliceret at erhverve en enkelt bakterieart.
<p class = "jove_content"> Her rapporterer vi en enkel og billig protokol til at isolere whitefly endosymbionter til efterfølgende metagenom-sekventering. Gennem dissektion, oprensning og amplifikation kunne der opnås tilstrækkeligt endosymbiont-DNA, og bakteriearten kunne bekræftes. Den beskrevne protokol kan anvendes på lignende måde i andre leddyr.Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiel støtte til dette studie blev leveret af National Key Research and Development Program (2016YFC1200601) og National Natural Science Foundation of China (31390421).
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
Referências
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O’Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts ‘Candidatus Fritschea bemisiae’ strain Falk and ‘Candidatus Fritschea eriococci’ strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
