Methoden voor de extractie van endosymbionten uit de Whitefly<em> Bemisia tabaci</em
Summary
Hier presenteren wij een protocol om endosymbionten van de whitefly Bemisia tabaci te isoleren door dissectie en filtratie. Na amplificatie zijn de DNA monsters geschikt voor latere sequencing en studie van de mutualiteit tussen endosymbionten en whitefly.
Abstract
Bacteriële symbionten vormen een intieme relatie met hun gastheren en geven in de meeste gevallen voordelen aan de gastheren. Genomische informatie is cruciaal om de functies en evolutie van bacteriële symbionten in hun gastheer te bestuderen. Aangezien de meeste symbionten niet in vitro kunnen worden gekweekt, zijn methoden om een adequate hoeveelheid bacteriën te isoleren voor genoom sequencing zeer belangrijk. In de Whitefly Bemisia tabaci zijn een aantal endosymbionten geïdentificeerd en wordt voorspeld dat ze belangrijk zijn bij de ontwikkeling en voortplanting van de plaag door meerdere benaderingen. Het mechanisme van de verenigingen blijft echter grotendeels onbekend. Het obstakel komt ten dele uit het feit dat de endosymbionten in wittevlieg, die meestal in bacteriocyten worden vastgehouden, moeilijk zijn om van de gastheercellen te scheiden. Hier rapporteren we een stap-voor-stap protocol voor de identificatie, extractie en zuivering van endosymbionten uit de witte vlinder B. tabaci voornamelijk door dissectiAan en filtratie. Endosymbiont-monsters bereid volgens deze werkwijze, hoewel nog steeds een mengsel van verschillende endosymbiont-soorten, zijn geschikt voor latere genoomsequencing en analyse van de mogelijke rollen van endosymbionten in B. tabaci . Deze methode kan ook gebruikt worden om endosymbionten van andere insecten te isoleren.
Introduction
Bacteriën die een intieme symbiotische relatie met relatieve gastheren vormen zijn wijdverspreid bij geleedpotigen 1 . De endosymbionten zijn aangetoond dat ze aspecten van gastheren beïnvloeden, zoals voedingsmetabolisme, reproductie, reacties op milieu-stress 2 , 3 , 4 enz. , In bijna elke ontwikkelingsfase 5 . Het mechanisme dat de verenigingen ondersteunt, blijft echter grotendeels onbekend. Genomics heeft voorrang en belang bij het bestuderen van de potentiële functies en rollen van bacteriën. Enkele fundamentele informatie, dat wil zeggen de taxonomische status, functionele genen, metabolisme pathways, secretiesystemen, kan worden afgeleid uit genoomsequenties, die lichten op de potentiële rollen van symbionten in symbiose. Met de ontwikkeling van high-throughput sequencing is een groot aantal bacteriële genen sequenced wVerschillende functies onthulden 6 .
Endosymbionten zijn van vitaal belang in hemipteranen, zoals bladluizen 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , bruine planthoppers 10 en cicaden 11 . Bijvoorbeeld , Buchnera de bladluizen , als de verplichte symbiont, is aangetoond dat zij betrokken zijn bij essentiële aminozuren biosynthese, samen met de genen van aphid-genoom 12 . Verder wordt ook transcriptie-regulering van Buchnera geopenbaard 13 . In psylliden wordt Carsonella sequenced en wordt het kleinste bacteriegenoom ooit gevonden 14 . Al deze kenmerken van endosymbionten zijn gebaseerd en afgeleid van de genoomsequenties. Omdat deze endosymbionen niet in vitro kunnen worden gekweekt, zijn verschillende benaderingen toegepast om adequate bacteriën te isoleren voor zeefuencing. In bladluizen worden endosymbionten geëxtraheerd door middel van centrifugeren en filtratie, en onderworpen aan verdere genomische en transcriptomische analyse 5 . In bruine planthoppers worden endosymbionten samen met het hele insectengenoom 10 getraceerd.
Whitefly B. tabaci is een soort complex met meer dan 35 morfologisch onderscheiden soorten (cryptische soorten), waaronder twee invasieve soorten over de hele wereld binnengevallen en de landbouwproductie enorme schade hebben veroorzaakt 15 . Van de nota hebben endosymbionten binnen de B. tabaci- soorten belang in de ontwikkeling van de plagen 16 . Tot op heden zijn acht endosymbionten geïdentificeerd in de whitefly, waaronder de verplichte symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum, en zeven secundaire symbionten Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea pt Hemipteriphilus gedefinieerd 17 , 18 .
In tegenstelling tot de eerder beschreven hemipteranen, is de whitefly B. tabaci een extreem klein insect dat slechts 1 mm lang is. De meeste endosymbionten zijn beperkt tot bacteriocyten 19 (gespecialiseerde cellen die symbionten bevatten, die bovendien bacteriën vormen in B. tabaci ). Bovendien kunnen deze endosymbionen niet in vitro worden gekweekt. De enige manier om endosymbionten van B. tabaci te verkrijgen is om de bacteriome te ontleden. Er is echter moeilijkheid in de dissectie. Ten eerste, de breekbare bacteriome verbindt altijd met andere weefsels van de whitefly, die moeilijk te scheiden is. Ten tweede beperkt de kleine grootte van de whitefly de isolatie van genoeg bacteriomen. Ten derde, endosymbionts cluster in de bacteriome, waardoor het extreem ingewikkeld om een enkele soort bacterie te verwerven.
<p class = "jove_content"> Hier rapporteren we een eenvoudig en goedkoop protocol om whitefly endosymbionts te isoleren voor latere metagenome sequencing. Door dissectie, zuivering en amplificatie kan adequaat endosymbiont-DNA worden verkregen en kan de soort bacteriën worden bevestigd. Het beschreven protocol kan op soortgelijke wijze in andere geleedpotigen gebruikt worden.Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiële steun voor deze studie is verstrekt door het Nationale Key Research and Development Program (2016YFC1200601) en de National Natural Science Foundation of China (31390421).
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
Referências
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O’Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts ‘Candidatus Fritschea bemisiae’ strain Falk and ‘Candidatus Fritschea eriococci’ strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
