Méthodes d'extraction des endosymbionts de la mouche blanche<em> Bemisia tabaci</em
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour isoler les endosymbionts de la mouche blanche Bemisia tabaci par dissection et filtration. Après l'amplification, les échantillons d'ADN conviennent pour le séquençage ultérieur et l'étude du mutualisme entre les endosymbionts et la mouche blanche.
Abstract
Les symbiotes bactériens forment une relation intime avec leurs hôtes et confèrent des avantages aux hôtes dans la plupart des cas. L'information génomique est essentielle pour étudier les fonctions et l'évolution des symbiotes bactériens dans leur hôte. Comme la plupart des symbiotes ne peuvent pas être cultivés in vitro , les méthodes pour isoler une quantité adéquate de bactéries pour le séquençage du génome sont très importantes. Dans la mouche blanche Bemisia tabaci , un certain nombre d'endosymbionts ont été identifiés et sont prévus pour être importants dans le développement et la reproduction des ravageurs par de multiples approches. Cependant, le mécanisme qui sous-tend les associations reste largement inconnu. L'obstacle provient en partie du fait que les endosymbionts de la mouche blanche, principalement retenus dans les bactériocytes, sont difficiles à séparer des cellules hôtes. Nous rapportons ici un protocole étape par étape pour l'identification, l'extraction et la purification des endosymbionts de la mouche blanche B. tabaci principalement par dissectiEt la filtration. Les échantillons d'endosymbiont préparés par cette méthode, bien qu'étant encore un mélange de différentes espèces d'endosymbiont, conviennent pour le séquençage ultérieur du génome et l'analyse des rôles possibles des endosymbionts dans B. tabaci . Cette méthode peut également être utilisée pour isoler les endosymbionts d'autres insectes.
Introduction
Les bactéries formant une relation symbiotique intime avec des hôtes relatifs sont répandues dans les arthropodes 1 . Les endosymbionts ont été démontrés pour affecter les aspects des hôtes, tels que le métabolisme nutritionnel, la reproduction, les réponses aux contraintes environnementales 2 , 3 , 4 , etc. , dans presque tous les stades de développement 5 . Cependant, le mécanisme qui sous-tend les associations reste encore largement inconnu. La génomique est une priorité et une importance pour l'étude des fonctions et des rôles potentiels des bactéries. Certaines informations fondamentales, c'est-à-dire l'état taxonomique, les gènes fonctionnels, les voies du métabolisme, les systèmes de sécrétion, peuvent être déduites des séquences génomiques, ce qui permet de faire apparaître les effets potentiels des symbioses en symbiose. Avec le développement du séquençage à haut débit, un grand nombre de génomes bactériens ont été séquencés wDes fonctions diverses ont été révélées 6 .
Les endosymbionts revêtent une importance vitale dans les hémiptères, tels que les pucerons 7 , les punaises 8 , les psyllides 9 , les planthoppers marrons 10 et les cigales 11 . Par exemple, Buchnera dans les pucerons, en tant que symbiont obligé, a été démontré être impliqué dans la biosynthèse des acides aminés essentiels, ainsi que les gènes du génome du phosphore 12 . En outre, la régulation transcriptionnelle de Buchnera est également révélée 13 . Dans les psyllides, Carsonella est séquencée et classé le plus petit génome bactérien jamais trouvé 14 . Toutes ces caractéristiques des endosymbionts sont basées et déduites des séquences génomiques. Étant donné que ces endosymbionts ne peuvent pas être cultivés in vitro , plusieurs approches ont été appliquées pour isoler des bactéries adéquates pour seqUencing. Dans les pucerons, les endosymbionts sont extraits par centrifugation et filtration et soumis à d'autres analyses génomiques et transcriptomiques 5 . Chez les planthoppers marrons, les endosymbionts sont séquencés avec l'ensemble du génome de l'insecte 10 .
Whitefly B. tabaci est un complexe d'espèces contenant plus de 35 espèces morphologiquement indiscernables (espèces cryptiques), dont deux espèces envahissantes ont envahi dans le monde entier et ont causé d'énormes dommages à la production agricole 15 . Il est à noter que les endosymbionts dans les espèces B. tabaci ont montré de l'importance dans le développement des ravageurs 16 . À ce jour, huit endosymbionts ont été identifiés dans la mouche blanche, y compris le symbiont obligatoire , Candidatus Portiera aleyrodidarum et sept symbionts secondaires Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea et Hemipteriphilus ont défini 17 , 18 .
Contrairement aux hémiptères décrits précédemment, la mouche blanche B. tabaci est un insecte extrêmement minuscule d'une longueur de seulement 1 mm. La plupart des endosymbionts sont confinés aux bactériocytes 19 (cellules spécialisées contenant des symbiotes, qui forment encore une bactérie à B. tabaci ). En outre, ces endosymbionts ne peuvent pas être cultivés in vitro . La seule façon d'obtenir des endosymbionts de B. tabaci consiste à disséquer la bactériométrie. Cependant, il y a des difficultés dans la dissection. Tout d'abord, la bactériule fragile se lie toujours avec d'autres tissus de la mouche blanche, ce qui est difficile à séparer. Deuxièmement, la petite taille de la mouche blanche limite l'isolement de suffisamment de bactériome. Troisièmement, les endosymbionts se regroupent dans la bactériome, ce qui rend extrêmement compliqué l'acquisition d'une seule espèce de bactérie.
<p class = "jove_content"> Ici, nous signalons un protocole simple et peu coûteux pour isoler les endosymbionts de la mouche blanche pour le séquençage ultérieur du metagenome. Par dissection, purification et amplification, un ADN endosymbiont adéquat pourrait être obtenu et les espèces de bactéries pourraient être confirmées. Le protocole décrit peut être utilisé de manière similaire dans d'autres arthropodes.Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'appui financier de cette étude a été fourni par le Programme national de recherche et de développement clés (2016YFC1200601) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31390421).
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
Referências
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