Metodi per l'estrazione di Endosymbionts dalla Whitefly<em> Bemisia tabaci</em
Summary
Qui presentiamo un protocollo per isolare endosymbionts dalla whitefly Bemisia tabaci attraverso la dissezione e la filtrazione. Dopo l'amplificazione, i campioni di DNA sono idonei per sequenziare e studiare successivamente il mutualismo tra endosymbionts e whitefly.
Abstract
I simbionti batterici formano una relazione intima con i loro ospiti e conferiscono vantaggi agli ospiti nella maggior parte dei casi. Le informazioni genomiche sono fondamentali per studiare le funzioni e l'evoluzione dei simbionti batterici nel loro ospite. Poiché la maggior parte dei simbionti non possono essere coltivati in vitro , sono molto importanti metodi per isolare un'adeguata quantità di batteri per il sequenziamento dei genomi. Nella bianca Bemisia tabaci , sono stati identificati diversi endosymbionts e sono previsti di grande importanza nello sviluppo e nella riproduzione dei parassiti attraverso approcci multipli. Tuttavia, il meccanismo che sostiene le associazioni rimane in gran parte sconosciuto. L'ostacolo deriva parzialmente dal fatto che gli endosymbionts in whitefly, perlopiù restrittivi nei batteriociti, sono difficili da separare dalle cellule ospite. Qui riportiamo un protocollo passo per passo per l'identificazione, l'estrazione e la purificazione di endosymbionts dalla bianca B. tabaci principalmente da dissectiOn e filtrazione. I campioni di endosimbione preparati con questo metodo, pur essendo ancora una miscela di diverse specie endosimbiotici, sono adatti per la sequenza successiva del genoma e l'analisi dei possibili ruoli degli endosimbiotici in B. tabaci . Questo metodo può anche essere usato per isolare endosymbionts da altri insetti.
Introduction
I batteri che formano una relazione intima e simbiotica con i relativi padroni sono diffusi negli artropodi1. Gli endosymbionts sono stati dimostrati di influenzare gli aspetti degli ospiti, come il metabolismo nutrizionale, la riproduzione, le risposte alle sollecitazioni ambientali 2 , 3 , 4 ecc . In quasi ogni fase di sviluppo 5 . Tuttavia, il meccanismo che sostiene le associazioni resta ancora in gran parte sconosciuto. La genomica è di priorità ed importanza quando studia le potenziali funzioni ei ruoli dei batteri. Alcune informazioni fondamentali, vale a dire lo status tassonomico, i geni funzionali, i percorsi di metabolismo, i sistemi di secrezione, possono essere dedotti dalle sequenze genomiche, che spariscono le potenziali ruoli dei simbionti in simbiosi. Con lo sviluppo di sequenziamenti ad alta percentuale, sono stati sequenziati un vasto numero di genomi battericiIth diverse funzioni rivelate 6 .
Gli endosimbieti sono di vitale importanza per gli emipterani, quali gli afidi 7 , i cimici 8 , i psyllids 9 , i pianthoppers marroni 10 e le cicale 11 . Per esempio, Buchnera negli afidi, come il simbiont obbligatorio, è stato dimostrato di essere coinvolto nella biosintesi essenziale di aminoacidi, insieme ai geni del genoma aphid 12 . Inoltre, viene rivelata anche la regolazione trascrizionale di Buchnera 13 . In psyllids , Carsonella viene sequenziato e classificato il genoma batterico più piccolo mai trovato 14 . Tutti questi segni distintivi degli endosymbionts sono basati e dedotti dalle sequenze del genoma. Poiché questi endosymbionts non possono essere coltivati in vitro , sono stati applicati diversi approcci per isolare batteri adeguati per sequenzare. Negli afidi, gli endosimbieti vengono estratti mediante centrifugazione e filtrazione e sottoposti ad ulteriore analisi genomica e transcriptomica 5 . Nelle piante marrone, gli endosimbieti sono sequenziati insieme a tutto il genoma degli insetti 10 .
Whitefly B. tabaci è un complesso di specie che contiene più di 35 specie morfologicamente indistinguibili (specie criptiche), tra le quali due specie invasive hanno invaso in tutto il mondo e hanno causato enormi danni alla produzione agricola 15 . Da notare, endosymbionts all'interno delle specie B. tabaci hanno mostrato importanza nello sviluppo dei parassiti 16 . Fino ad oggi sono stati identificati otto endosimbiotici, tra cui il simbionto obbligatorio, Candidatus Portiera aleyrodidarum e sette simbionti secondari Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,Em> Wolbachia, Fritschea e Hemipteriphilus definito 17 , 18 .
A differenza degli hemipterani descritti in precedenza, la bianca B. tabaci è un insetto estremamente piccolo solo di 1 mm di lunghezza. La maggior parte degli endosymbionts sono limitati ai bacteriosi 19 (cellule specializzate contenenti simbioni, che formano ulteriormente il batterio in B. tabaci ). Inoltre, questi endosymbionts non possono essere coltivati in vitro . L'unico modo per ottenere endosymbionts da B. tabaci è quello di disseccare il batterio fuori. Tuttavia, c'è difficoltà nella dissezione. Innanzitutto, il fragile batterioma si collega sempre con altri tessuti della bianca, difficilmente separabile. In secondo luogo, la piccola dimensione della bianca limita l'isolamento di batteriomi sufficienti. In terzo luogo, l'endosymbionts cluster nel batterio, rendendo estremamente complicato l'acquisizione di una singola specie di batterio.
<p class = "jove_content"> Qui segnalate un protocollo semplice e poco costoso per isolare endosymbionts di whitefly per successivi sequenziamenti di metagenomi. Attraverso la dissezione, la purificazione e l'amplificazione, si ottiene un adeguato DNA endosymbiont e la specie di batteri poteva essere confermata. Il protocollo descritto può essere usato in modo analogo in altri artropodi.Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il sostegno finanziario a questo studio è stato fornito dal National Key Research and Development Programme (2016YFC1200601) e dalla National Science Foundation of China (31390421).
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
Referências
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