Apresentamos protocolos para a aplicação de nosso indicador de cálcio codificado geneticamente codificado (GECI) CatchER + para monitorar transientes rápidos de cálcio no retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 e células C2C12 de músculo esquelético usando microscopia de fluorescência em tempo real. Um protocolo para a medição e calibração in situ K d também é discutido.
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Artigo de método
Monitorização da libertação de cálcio ER / SR com o Ca
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os transientes intracelulares de cálcio (Ca2 + ) evocados por estímulos extracelulares iniciam uma multiplicidade de processos biológicos em organismos vivos. No centro da libertação de cálcio intracelular estão as principais organelas de armazenamento de cálcio intracelular, o retículo endoplasmático (RE) eo retículo sarcoplasmático (SR) mais especializado nas células musculares. A liberação dinâmica de cálcio a partir destas organelas é mediada pelo receptor de rianodina (RyR) e pelo receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) com reenchimento ocorrendo através da bomba sarco / retina de cálcio reticular ATPase (SERCA). Um sensor de cálcio geneticamente codificado (GECI) chamado CatchER foi criado para monitorar a rápida liberação de cálcio do ER / SR. Aqui, os protocolos detalhados para a transfecção e expressão do GECI CatchER + melhorado em células HEK293 e C2C12 direccionadas para ER / SR e a sua aplicação na monitorização de transiente de cálcio mediado por bomba IP3R, RyR e SERCAS em células HEK293 utilizando microscopia de fluorescência é delineada. O agonista ou inibidor de receptor de escolha está disperso na solução de câmara e as alterações de intensidade são registadas em tempo real. Com este método, observa-se uma diminuição do cálcio ER com a activação de RyR com 4-cloro-m-cresol (4 cmc), a activação indirecta de IP3R com adenosina trifosfato (ATP) ea inibição da bomba SERCA com ciclopiazónico Ácido (CPA). Também discutimos protocolos para determinar o in situ K d e quantificação basal [Ca 2 + ] em C2C12 células. Em resumo, estes protocolos, utilizados em conjunto com CatchER + , podem desencadear a libertação de cálcio mediada pelo receptor a partir da ER com aplicação futura no estudo de ER / SR relacionadas com cálcio patologias.
Introdução
Os atributos espaço-temporais dos transientes de cálcio intracelular (Ca 2+ ) ativam várias funções biológicas 1 . Estes eventos de sinalização de Ca2 + são desencadeados extracelularmente através de diferentes estímulos e controlados intracelularmente pela maior organela de armazenamento de Ca2 + e por numerosas bombas de Ca2 + , canais e proteínas de ligação de Ca2 + . Os transientes de Ca 2+ podem ser significativamente alterados como resultado de defeitos com modulação do sinal, levando a diferentes doenças 2 . Devido à velocidade e complexidade do si....
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Protocolo
1. Preparação do Slide
- Coloque as lâminas de microscópio de vidro de 22 mm x 40 mm em placas de cultura celular de 6 cm, 1 lâmina por prato.
- Exponha cada lado de cada lâmina, bem como o prato de 6 cm à luz ultravioleta (UV) por 15-20 min para esterilizar em uma capa estéril.
- Cubra os pratos com lâminas dentro com parafilme e armazene a 4 ° C até pronto para usar.
2. Preparação de meios, tampões, soluções e reagentes
- Preparar 1 L de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) em água desionizada e adicionar HEPES 10 mM, NaHCO3 5 mM e EGTA 1 mM. Ajustar para pH 7,2-7,3 com NaOH. Filtrar o tampão....
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Resultados
Esta secção irá ilustrar os resultados que foram alcançados utilizando os métodos descritos anteriormente utilizando o optimizado ER / SR-alvo GECI CatchER + para monitorar mudanças em ER / SR Ca 2 + através de diferentes vias mediadas pelo receptor.
A Figura 1 ilustra o esvaziamento de ER através do RyR estimulado com 200 μM de 4 cmc. 4-cmc é um agonista do RyR. A adição do .......
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Discussão
A imagiologia com células vivas de sondas fluorescentes, tal como CatchER + , é uma técnica eficaz para analisar processos de sinalização intrínsecos de ER / SR Ca2 + em cada célula em resposta a agonistas ou antagonistas de receptores. Esta técnica também é útil para imagens usando múltiplos comprimentos de onda simultaneamente, como necessário para Fura-2 ou para a imagem CatchER + e Rhod-2 em conjunto para monitorar ER e citosólicas alterações de cálcio, respectivamente. Existem vária.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, e um NIH Suplementar Grant para FR, BB bolsa para CM, CDT bolsa para RG.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4-Cloro-3-metilfenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR espelho dicróico | Chroma Technology Corp. | ||
| Adenosina 5′-trifosfato dissódico sal hidratado | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Cloreto de cálcio di-hidratado | EMD Millipore | 102382 | |
| Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos Corning (100 mm) | Placas de cultura tratadas com cultura de tecidos Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Corning (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Ácido ciclopiazônico (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D (+) -glicose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Lubrificante de válvula e Selante | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco' s Águia Modificada' s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ácido Etilenobis(oxietilenoenitrilo) tetracético (EGTA) | ACROS Organics | 409911000 | |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Óculos de Cobertura 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks ' Sais Balanceados (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Ácido Livre, Grau de Biologia Molecular | EMD Millipore | 391340 | |
| Óleo de Imersão sem autofluorescência | Leica | 11513859 | |
| Ionomicina, Ácido Livre | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B microscópio invertido com uma câmera EM-CCD resfriada | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Reagente de Transfecção de Lipofectamina 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Reagente de Transfecção de Lipofectamina 3000 | ThermoFisher | L3000015 | |
| Banho de Diamante Aberto de Perfil Baixo Warner | Instruments | RC-26GLP | |
| Cloreto de Magnésio Hexahidratado | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Cloreto de Potássio | EMD Millipore | PX1405 | |
| Fosfato de Potássio, Dibásico | EMD Millipore | PX1570 | |
| Fosfato de Potássio, Monobásico | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Software de Análise de Imagem | Hamamatsu | N/A | |
| Bicarbonato de Sódio | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Cloreto de Sódio | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µ Filtro EMD | Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Policromado V Lâmpada de xenônio | Till Photonics | N/A | |
| Tripsina (2,5%), sem vermelho de fenol (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
Referências
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish....
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Reimpressões e permissões
