Monitoring ER / SR Calciumvrijstelling met de gerichte Ca<sup> 2+</sup> Sensor CatchER<sup> +</sup
Summary
Wij presenteren protocollen voor de toepassing van onze genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) CatchER + voor het monitoren van snelle calcium transiënten in het endoplasmatische / sarcoplasmatische reticulum (ER / SR) van HEK293 en skeletspier C2C12 cellen met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Een protocol voor de in-situ K d meting en kalibratie wordt ook besproken.
Abstract
Intracellulaire calcium (Ca 2+ ) transiënten die door extracellulaire stimuli worden opgewekt, beginnen een groot aantal biologische processen in levende organismen. In het centrum van intracellulaire calciumvrijstelling zijn de belangrijkste intracellulaire calciumopslagorganellen, het endoplasmatische reticulum (ER) en het meer gespecialiseerde sarcoplasmatische reticulum (SR) in spiercellen. De dynamische afgifte van calcium uit deze organellen wordt gemedieerd door de ryanodine-receptor (RyR) en de inositol 1,4,5-trifosfaatreceptor (IP 3 R) met hervulling die plaatsvindt via de sarco / endoplasmatische reticulum calcium ATPase (SERCA) pomp. Een genetische gecodeerde calciumsensor (GECI) genaamd CatchER werd gecreëerd om de snelle calciumvrijstelling van de ER / SR te controleren. Hier zijn de gedetailleerde protocollen voor de transfectie en expressie van de verbeterde, ER / SR-gerichte GECI CatchER + in HEK293- en C2C12-cellen en zijn toepassing bij het monitoren van IP 3 R, RyR en SERCA pompgemedieerde calcium transientS in HEK293 cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie wordt geschetst. De gekozen receptor-agonist of -remmer wordt in de kameroplossing gedispergeerd en de intensiteitsveranderingen worden in real time opgenomen. Met deze methode wordt een vermindering van ER-calcium gezien met RyR-activering met 4-chlor-m-cresol (4 cmc), de indirecte activatie van IP 3 R met adenosintrifosfaat (ATP) en remming van de SERCA-pomp met cyclopiazonzuur Zuur (CPA). We bespreken ook protocollen om de in situ K d en kwantificerende basale [Ca 2+ ] in C2C12 cellen te bepalen. Samenvattend kunnen deze protocollen, gebruikt in combinatie met CatchER + , receptor-gemedieerde calciumvrijstelling van het ER ontlokken bij toekomstige toepassing bij het bestuderen van ER / SR-calcium gerelateerde pathologieën.
Introduction
De spatio-temporale eigenschappen van intracellulaire calcium (Ca 2+ ) transiënten activeren verschillende biologische functies 1 . Deze Ca 2+ signalerende gebeurtenissen worden extracellulaire door middel van verschillende stimuli geactiveerd en intracellulair geregeld door de grote Ca 2+ opslagorganelle en door talrijke Ca 2+ pompen, kanalen en Ca 2+ bindende eiwitten. Ca 2+ transiënten kunnen significant worden veranderd als gevolg van defecten met signaalmodulatie, die leiden tot verschillende ziekten 2 . Vanwege de snelheid en ingewikkeldheid van het Ca 2+ signaleringssysteem, met het endo- (ER) en sarcoplasmatische reticulum (SR) in het centrum, zijn genetisch gecodeerde Ca 2+ -probes die zijn geoptimaliseerd voor zoogdieruitdrukking met snelle kinetiek nodig Global en lokale Ca 2+ veranderingen in verschillende cellen waarnemen 3 .
De ER en de SR, Zijn tegenhanger in spiercellen, zijn de belangrijkste intracellulaire Ca 2+ opslagorganellen en fungeren als Ca 2+ wastafels die helpen om het Ca 2+ -signaal 4 te versterken. De ER / SR is een integraal onderdeel in Ca 2+ signalering met dubbele rollen als een zender en ontvanger van signalen 5 . De ryanodine-receptor (RyR) en de inositol-1,4,5-trifosfaatreceptor (IP 3R) zijn Ca 2+ -vrijgegeven receptoren die zich bevinden op de membranen van de ER / SR die gereguleerd worden door Ca 2+ 6 . Andere agenten stimuleren de functie van deze receptoren direct of indirect. 4-chloor-m-cresol (4-cmc) is een krachtige agonist van het RyR, met een 10-voudige hogere gevoeligheid dan cafeïne voor het induceren van SR Ca 2+ vrijlating, waarbij beide regelmatig worden gebruikt om RyR-gemedieerde Ca 2+ -vrijgave te bestuderen in Gezonde en zieke cellen 7 . ATP verhoogt IP 3- gemedieerde Ca 2+ reHuur via het IP 3 R 8 . ATP bindt aan de purinergere receptor P2YR, een G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR), waardoor de productie van IP 3 wordt geactiveerd die bindt aan de IP 3 R om Ca 2+ van de ER 9 , 10 te laten vrijkomen. De pomp ATPase (SERCA) van de sarco-endoplasmatische reticulum-calcium ATPase is een P-type ATPase-pomp, ook op het ER / SR-membraan dat cytosolische Ca 2+ vermindert en de ER / SR refillert door de ion actief in de ER / SR lumen te pompen 11 . Specifieke remmers van de SERCA-pomp omvatten thapsigargine, van Thapsia garganica , en cyclopiazonzuur (CPA), van Aspergillus pt Penicillium . CPA heeft een lage affiniteit voor de pomp en reversibel blokkeert het Ca 2+ toegangspunt 12 . Thapsigargin bindt daarentegen onherstelbaar aan de Ca 2+ vrije pomp bij residu F256 in de M3-helix met nanomolAr affiniteit 11 . Het analyseren en kwantificeren van de veranderingen die betrokken zijn bij Ca 2+ gestimuleerde gebeurtenissen is en blijft een uitdaging. Aangezien de ER / SR het belangrijkste subcellulaire Ca 2+ bevattende compartiment is met een centrale functie bij de voortplanting van het Ca 2+ signaal, is veel werk gericht op het begrijpen van ER / SR Ca 2+ signalering 5 .
De creatie van synthetische Ca 2+ kleurstoffen hielp het veld en de praktijk van Ca 2+ beeldvorming. Hoewel kleurstoffen, zoals Mag-Fura-2, veel gebruikt zijn om gecompartementaliseerde Ca 2+ in verschillende cellen te meten, hebben ze 13 , 14 , 15 beperkingen zoals oneven kleurstofbelasting, fotobladen en het onvermogen om zich te richten op specifieke organellen . De ontdekking van het groene fluorescerende eiwit (GFP) en de bevordering van fluorescerende eiwit-Gebaseerde Ca 2+ probes heeft het veld van Ca 2+ beeldvorming naar voren gebracht 16 . Enkele van de bestaande GECI's zijn Förster resonantie energie-overdracht (FRET) paren die geel fluorescerend eiwit (YFP), cyaan fluorescerend eiwit (CFP), calmodulin en het M13 bindende peptide 17 , 18 omvatten . Troponine C-gebaseerde GECI's zijn ook beschikbaar als FRET-paren CFP en Citrine en als enkele fluorofore probes 19 , 20 , 21 . Anderen, zoals GCaMP2 en R-GECO, zijn enkele fluorofoor sensoren die Calmodulin 22 , 23 betreffen. Om de beperkingen van de smalle afstemming van Kd's en coöperatieve binding te elimineren die geassocieerd zijn met meerdere Ca2 + bindingsplaatsen die in hun Ca2 + bindende domeinen 24 gevonden worden , een nieuwe klasse van calcium senSors werd gecreëerd door een Ca 2+ bindingsplaats op het oppervlak van het bèta vat op te stellen in een chromofore gevoelige locatie van verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) 25 , 26 . Deze zeer voorspelde sensor, genaamd CatchER, heeft een Kd van ~ 0,18 mM, ak dichtbij de diffusielimiet en ak van 700 s -1 . CatchER is gebruikt om receptor-gemedieerde ER / SR calcium vrijgave in verschillende zoogdiercellijnen zoals HeLa, HEK293 en C2C12 25 te controleren. Door zijn snelle kinetiek werd CatchER gebruikt in flexor digitorum brevis (FDB) spiervezels van jonge en oude Friend Virus B NIH Jackson (FVB) muizen om te onthullen dat meer Ca 2+ in de SR achterblijft na 2 s depolarisatie in de FDB Vezels van oude muizen vergeleken met die van jonge muizen 27 . Om zijn lage fluorescentie bij 37 ° C te overwinnen, die haar toepassingen bij het calciumbeelden van zoogdier verhindertCellen hebben we een verbeterde versie van CatchER ontwikkeld, genaamd CatchER + . CatchER + vertonen verbeterde fluorescentie bij 37 ° C voor betere toepassing in zoogdiercellen. Aanvullende mutaties werden opgenomen in CatchER om de thermostabiliteit en fluorescentie bij 37 ° C 28 , 29 te verbeteren om CatchER + te creëren. CatchER + vertoont een zesvoudige toename van de signaal-ruisverhouding (SNR) over CatchER 30 .
Hier worden de protocollen voor de cultuur en transfectie van HEK293- en C2C12-cellen met CatchER + en de toepassing ervan voor het monitoren van ER / SR-receptor-gemedieerde calciumtransiënten weergegeven. Representatieve resultaten worden getoond voor CatchER + uitgedrukt in HEK293 cellen behandeld met 4 cmc, CPA en ATP. We bieden ook een protocol voor de bepaling van de in situ K d van CatchER + in C2C12 myoblastcellen en quaNtificatie van basale [Ca 2+ ].
Protocol
Representative Results
Discussion
Live single-cell imaging van fluorescerende probes, zoals CatchER + , is een effectieve techniek om ingewikkelde ER / SR Ca 2+ signalering processen in elke cel te analyseren in reactie op receptor agonisten of antagonisten. Deze techniek is ook bruikbaar voor imaging met meerdere golflengten tegelijkertijd, zoals nodig voor Fura-2 of image CatchER + en Rhod-2 samen om respectievelijk respectievelijk ER en cytosolische calciumveranderingen te controleren. Er zijn verschillende kritische …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant en een NIH Aanvullende Grant naar FR, BB-fellowship naar CM, CDT-gemeenschap aan RG.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
Referências
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Bioquímica. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. . Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. . Calcium signaling protocols. , (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).
