Overvåking av ER / SR-kalsiumfrigivelse med målrettet Ca²⁺ Sensor CatchER<sup> +</sup

Summary

Vi presenterer protokoller for bruk av vår målrettede, genetisk kodede kalsiumindikator (GECI) CatchER ⁺ for overvåkning av hurtige kalsiumtransienter i det endoplasmatiske / sarkoplasmiske retikulum (ER / SR) av HEK293 og skjelettmuskulatur C2C12-celler ved bruk av sanntids fluorescensmikroskopi. En protokoll for in situ K _d måling og kalibrering diskuteres også.

Abstract

Intracellulære kalsium (Ca ²⁺ ) transienter fremkalt av ekstracellulære stimuli initierer en rekke biologiske prosesser i levende organismer. I midten av intracellulær kalsiumfrigivelse er de viktigste intracellulære kalsiumlagringsorganeller, endoplasmatisk retikulum (ER) og mer spesialisert sarkoplasmisk retikulum (SR) i muskelceller. Den dynamiske frigjøringen av kalsium fra disse organeller formidles av ryanodinreseptoren (RyR) og inositol 1,4,5-trifosfatreceptor (IP ₃ R) med påfylling som skjer via sarco / endoplasmatisk retikulumkalsium ATPase (SERCA) -pumpen. En genetisk kodet kalsiumsensor (GECI), kalt CatchER, ble opprettet for å overvåke hurtig kalsiumfrigivelse fra ER / SR. Her er de detaljerte protokollene for transfeksjon og ekspresjon av den forbedrede, ER / SR-målrettede GECI CatchER ⁺ i HEK293- og C2C12-celler og dens anvendelse i overvåking av IP ₃ R, RyR og SERCA-pumpemidlet kalsiumtransientS i HEK293-celler ved bruk av fluorescensmikroskopi er skissert. Reseptoragonisten eller inhibitoren som er valgt, dispergeres i kammerløsningen, og intensitetsendringene registreres i sanntid. Med denne metoden blir en reduksjon i ER-kalsium sett med RyR-aktivering med 4-klor-m-kresol (4 cm), den indirekte aktiveringen av IP ₃ R med adenosintrifosfat (ATP) og inhibering av SERCA-pumpen med cyklopiazon Syre (CPA). Vi diskuterer også protokoller for å bestemme in situ K _d og kvantifisere basal [Ca ²⁺ ] i C2C12-celler. I sammendraget kan disse protokollene, brukt i forbindelse med CatchER ⁺ , fremkalle reseptormediert kalsiumfrigivelse fra ER med fremtidig anvendelse ved å studere ER / SR kalsiumrelaterte patologier.

Introduction

De spatio-temporale egenskapene til intracellulære kalsium (Ca ²⁺ ) transienter aktiverer ulike biologiske funksjoner ¹ . Disse Ca ²⁺ signaleringshendelsene utløses ekstracellulært gjennom forskjellige stimuli og kontrolleres intracellulært av den store Ca ²⁺ lagringsorganelle og ved en rekke Ca ²⁺ pumper, kanaler og Ca ²⁺ bindingsproteiner. Ca ²⁺ transienter kan endres vesentlig som følge av defekter med signalmodulasjon, som fører til forskjellige sykdommer ² . På grunn av hastigheten og kompleksiteten til Ca ²⁺ -signaleringssystemet, med endo- (ER) og sarkoplasmisk retikulum (SR) i midten, er det nødvendig med genetisk kodede Ca ²⁺ -prober som er optimalisert for pattedyrsuttrykk med hurtig kinetikk. Å observere globale og lokale Ca ²⁺ endringer i forskjellige celler ³ .

ER og SR, Dens motstykke i muskelceller, er de viktigste intracellulære Ca ²⁺ lagringsorganeller og fungerer som Ca ²⁺ vasker som bidrar til å forsterke Ca ²⁺ -signalet ⁴ . ER / SR er en integrert del i Ca ²⁺ -signalering med to roller som en sender og mottaker av signaler ⁵ . Ryanodinreseptoren (RyR) og inositol 1,4,5-trifosfatreceptoren (IP ₃ R) er Ca ²⁺ -frigjøringsreceptorer lokalisert på membranene i ER / SR som er regulert av Ca ^{2+ 6} . Andre midler stimulerer direkte eller indirekte funksjonen til disse reseptorene. 4-klor-m-kresol (4-cmc) er en kraftig agonist av RyR, som har en 10 ganger høyere følsomhet enn koffein for å indusere SR Ca ²⁺ -frigjøring der begge regelmessig benyttes til å studere RyR-mediert Ca ²⁺ -frigjøring i Friske og syke celler ⁷ . ATP øker IP _3- mediert Ca ²⁺ reLeie gjennom IP ₃ R ⁸ . ATP binder til den purinergreceptor P2YR, en G-proteinkoblet reseptor (GPCR), som utløser produksjonen av IP ₃ som binder til IP ₃ R for å frigjøre Ca ²⁺ fra ER ^{9 , 10} . Seraco-endoplasmatisk retikulumkalsium ATPase (SERCA) -pumpen er en P-type ATPase-pumpe, også lokalisert på ER / SR-membranen som reduserer cytosolisk Ca ²⁺ og fyller ER / SR ved aktivt å pumpe ionet i ER / SR lumen ¹¹ . Spesifikke hemmere av SERCA-pumpen inkluderer thapsigargin, fra Thapsia garganica , og cyklopiazonsyre (CPA), fra Aspergillus og Penicillium . CPA har lav affinitet for pumpen og blokkerer reversibelt Ca ²⁺ tilgangspunktet ¹² . Thapsigargin, derimot, binder irreversibelt til Ca ²⁺ fri pumpe ved rest F256 i M3-helixen med nanomolAr affinitet ¹¹ . Analysere og kvantifisere endringene som er involvert i Ca ²⁺ stimulerte hendelser har vært og forblir en utfordring. Siden ER / SR er det store subcellulære Ca ²⁺ -holdige rommet med en sentral funksjon i utbredelsen av Ca ²⁺ -signalet, har mye arbeid vært fokusert på å forstå ER / SR Ca ²⁺ -signalering ⁵ .

Opprettelsen av syntetiske Ca ²⁺ fargestoffer bidro til å fremme feltet og praksis av Ca ²⁺ -bildebehandling. Selv om fargestoffer, som Mag-Fura-2, har vært mye brukt til å måle compartmentalized Ca ²⁺ i forskjellige celler, har ^{13 , 14 , 15} de begrensninger som ujevn fargestoffbelastning, fotoblekking og manglende evne til å målrettes mot bestemte organeller . Oppdagelsen av det grønne fluorescerende protein (GFP) og fremskriden av fluorescerende protein-Baserte Ca ²⁺ -prober har drevet feltet Ca ²⁺ avbildning fremover ¹⁶ . Noen av de eksisterende GECIene er Förster resonans energioverføring (FRET) par som involverer gul fluorescerende protein (YFP), cyan fluorescerende protein (CFP), calmodulin og M13 bindende peptid ^{17 , 18} . Troponin C-baserte GECI er også tilgjengelige som FRET-par CFP og Citrine og som enkeltfluoroforprober ^{19 , 20 , 21} . Andre, som GCaMP2 og R-GECO, er single fluorophore sensorer som involverer calmodulin ^{22 , 23} . For å overvinne begrensningene for smal innstilling av Kd 's og kooperativ binding assosiert med flere Ca2 ⁺ bindingssteder funnet i deres Ca2 ⁺ bindende domener ²⁴ , en ny klasse av kalsium senSors ble opprettet ved å designe et Ca ²⁺ bindingssted på overflaten av beta-fatet i en kromofore-følsom plassering av forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) ^{25 , 26} . Denne høyt opplyste sensoren, kalt CatchER, har en Kd på ~ 0,18 mM, ak _på nær diffusjonsgrensen, og ak _off av 700 s ^-1 . CatchER har blitt brukt til å overvåke reseptormediert ER / SR kalsiumfrigivelse i forskjellige pattedyrcellelinjer som HeLa, HEK293 og C2C12 ²⁵ . På grunn av sin hurtige kinetikk ble CatchER brukt i flexor digitorum brevis (FDB) muskelfibre av unge og gamle Friend Virus B NIH Jackson (FVB) mus for å avsløre at mer Ca ²⁺ forblir i SR etter 2 s av depolarisering i FDB Fibre av gamle mus sammenlignet med unges mus ²⁷ . For å overvinne sin lave fluorescens ved 37 ° C, som hindrer dets anvendelser ved kalsiumbilding av pattedyrCeller, har vi utviklet en forbedret versjon av CatchER kalt CatchER ⁺ . CatchER ⁺ utviser forbedret fluorescens ved 37 ° C for bedre anvendelse i pattedyrceller. Ytterligere mutasjoner ble innlemmet i CatchER for å forbedre termostabiliteten og fluorescensen ved 37 ° C ^{28 , 29} , for å skape CatchER ⁺ . CatchER ⁺ utviser en seks ganger økning i signal-støy-forholdet (SNR) over CatchER ³⁰ .

Her presenteres protokollene for kulturen og transfeksjonen av HEK293- og C2C12-celler med CatchER ⁺ og dens anvendelse for overvåking av ER / SR-reseptormedierte kalsiumtransienter. Representative resultater vises for CatchER ⁺ uttrykt i HEK293-celler behandlet med 4-cmc, CPA og ATP. Vi gir også en protokoll for å bestemme in situ K _d av CatchER ⁺ i C2C12 myoblastceller og quaNtifisering av basal [Ca ²⁺ ].

Protocol

1. Skyv forberedelse Plasser 22 mm x 40 mm glassmikroskopriller i 6 cm cellekulturretter, 1 lysbilde per fat. Utsett hver side av hvert lysbilde samt 6 cm tallerken til ultrafiolett (UV) lys i 15-20 minutter for sterilisering i en steril hette. Tørk opp servantene med lysbilder på innsiden med parafilm og lagre ved 4 ° C til bruksklar. 2. Fremstilling av medier, buffere, løsninger og reagenser Forbered 1 L av Hank balansert saltløsning (HB…

Representative Results

Denne delen vil illustrere resultatene som ble oppnådd ved hjelp av de tidligere beskrevne metodene ved å bruke den optimaliserte ER / SR-målrettede GECI CatchER + for å overvåke endringer i ER / SR Ca 2+ gjennom forskjellige reseptormedierte veier. Figur 1 illustrerer ER tømming gjennom RyR stimulert med 200 μM 4 cmc. 4-cmc er en agonist av RyR. Tilsetning av medikame…

Discussion

Levende enkeltcellet bildebehandling av fluorescerende prober, som CatchER ⁺ , er en effektiv teknikk for å analysere intrikate ER / SR Ca ²⁺ signalprosesser i hver celle som respons på reseptoragonister eller antagonister. Denne teknikken er også nyttig for avbildning ved bruk av flere bølgelengder samtidig, slik som nødvendig for Fura-2 eller til bilde CatchER ⁺ og Rhod-2 sammen for å overvåke henholdsvis henholdsvis ER- og cytosolisk kalsiumforandringer. Det er flere kritiske s…

Materials

4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR dichroic mirror	Chroma Technology Corp.	NC338059
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A26209
Calcium chloride dihydrate	EMD Millipore	102382
Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Cyclopiazonic Acid (CPA)	EMD Millipore	239805
D(+)-Glucose	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks’ Balanced Salts (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade	EMD Millipore	391340
Immersion Oil without autofluorescence	Leica	11513859
Ionomycin, Free Acid	Fisher Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	ThermoFisher	L3000015
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26GLP
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Potassium Chloride	EMD Millipore	PX1405
Potassium Phosphate, Dibasic	EMD Millipore	PX1570
Potassium Phosphate, Monobasic	EMD Millipore	PX1565
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Image Analysis Software	Hamamatsu	N/A
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-3
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µm filter	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Polychrome V Xenon lamp	Till Photonics	N/A
Trypsin (2.5%), no phenol red (10X)	ThermoFisher	15090046