Seguimiento de la liberación de calcio ER / SR con el Ca<sup> 2+</sup> Sensor de Captura<supUnesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org</sup
Summary
Presentamos protocolos para la aplicación de nuestro indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) CatchER + para el monitoreo de transitorios rápidos de calcio en el retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 y células C2C12 de músculo esquelético usando microscopía de fluorescencia en tiempo real. También se discute un protocolo para la medición y calibración in situ K d .
Abstract
Los transitorios intracelulares de calcio (Ca2 + ) evocados por estímulos extracelulares inician una multitud de procesos biológicos en organismos vivos. En el centro de la liberación de calcio intracelular se encuentran los principales organelos de almacenamiento de calcio intracelular, el retículo endoplasmático (RE) y el retículo sarcoplasmático (SR) más especializado en las células musculares. La liberación dinámica de estos orgánulos está mediada por el receptor de ryanodina (RyR) y el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), con relleno que ocurre a través de la bomba sarco / retina de calcio cálcica (SERCA). Se creó un sensor de calcio codificado genéticamente (GECI) llamado CatchER para monitorizar la liberación rápida de calcio de la ER / SR. En este caso, los protocolos detallados para la transfección y expresión de la mejorada, ER / SR-GECI objetivo CatchER + en células HEK293 y C2C12 y su aplicación en la monitorización de IP3 R, RyR, y SERCA mediada por la bomba de calcio transitoriaS en células HEK293 usando microscopía de fluorescencia. El agonista o inhibidor receptor de elección se dispersa en la solución de cámara y los cambios de intensidad se registran en tiempo real. Con este método, se observa una disminución del calcio ER con activación de RyR con 4-cloro-m-cresol (4 cmc), la activación indirecta de IP3R con adenosina trifosfato (ATP) e inhibición de la bomba SERCA con ciclopiazónicos Ácido (CPA). También discutimos protocolos para determinar el K d in situ y la cuantificación basal [Ca 2 + ] en C2C12 células. En resumen, estos protocolos, utilizados junto con CatchER + , pueden provocar la liberación de calcio mediada por receptores de la ER con aplicación futura en el estudio ER / SR relacionadas con calcio patologías.
Introduction
Los atributos espacio-temporales de los transitorios intracelulares de calcio (Ca 2+ ) activan diversas funciones biológicas 1 . Estos eventos de señalización de Ca2 + son desencadenados extracelularmente a través de diferentes estímulos y controlados intracelularmente por el principal organelo de almacenamiento de Ca2 + y por numerosas bombas de Ca2 + , canales y proteínas de unión a Ca2 + . Ca 2 + transitorios pueden ser significativamente alterado como resultado de los defectos con la modulación de la señal, dando lugar a diferentes enfermedades [ 2] . Debido a la velocidad y complejidad del sistema de señalización de Ca 2 + , con el retículo endo- (ER) y sarcoplásmico (SR) en el centro, las sondas de Ca 2+ genéticamente codificadas que se han optimizado para la expresión de mamíferos con cinética rápida son necesarias Para observar global y local Ca 2 + cambios en diferentes células [ 3] .
El ER y el SR, Su contrapartida en las células musculares, son los principales organelos de almacenamiento intracelular de Ca 2+ y actúan como sumideros de Ca 2+ que ayudan a amplificar la señal de Ca 2 + 4 . El ER / SR es una parte integral de Ca 2 + señalización con funciones duales como un transmisor y receptor de señales [ 5] . El receptor de ryanodina (RyR) y el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son receptores de liberación de Ca2 + localizados en las membranas de la ER / SR reguladas por Ca2 + 6 . Otros agentes estimulan directa o indirectamente la función de estos receptores. El 4-cloro-m-cresol (4 cmc) es un potente agonista del RyR, que tiene una sensibilidad 10 veces mayor que la cafeína para inducir la liberación de SR Ca 2+ , donde ambos se emplean regularmente para estudiar la liberación de Ca 2+ mediada por RyR en Sanas y enfermas 7 . ATP aumenta el Ca 2+ mediado por IP 3Arrendamiento a través del IP 3 R 8 . El ATP se une al receptor purinérgico P2YR, un receptor acoplado a proteína G (GPCR), desencadenando la producción de IP3 que se une al IP3R para liberar Ca2 + del ER 9,10. La bomba de ATPasa de calcio reticular sarco-endoplasmático (SERCA) es una bomba ATPasa de tipo P, también localizada en la membrana ER / SR que reduce el Ca 2+ citosólico y rellena el ER / SR bombeando activamente el ion en el lumen ER / SR 11 . Los inhibidores específicos de la bomba SERCA incluyen tapsigargina, de Thapsia garganica y ácido ciclopiazónico (CPA), de Aspergillus y Penicillium . CPA tiene una afinidad baja para la bomba y bloquea de forma reversible el punto de acceso Ca 2 + 12 . La tapsigargina, por otra parte, se une irreversiblemente a la bomba libre de Ca2 + en el residuo F256 en la hélice M3 con nanomolAr afinidad 11 . El análisis y la cuantificación de los cambios implicados en los eventos estimulados con Ca 2+ ha sido y sigue siendo un desafío. Dado que la ER / SR es el principal subcelular Ca 2 + conteniendo el compartimiento con una función central en la propagación de la señal de Ca 2 + , mucho trabajo se ha centrado en la comprensión de ER / SR Ca 2 + señalización [ 5] .
La creación de colorantes sintéticos de Ca 2 + ayudó a avanzar el campo y la práctica de la formación de imágenes de Ca 2+ . Aunque los colorantes, como Mag-Fura-2, han sido ampliamente utilizados para medir Ca 2 + compartimentado en diferentes células, 13 , 14 , 15 tienen limitaciones tales como carga de colorante desigual, fotoblanqueo y la incapacidad para ser dirigidos a organelos específicos . El descubrimiento de la proteína verde fluorescente (GFP) y el avance de la proteína fluorescente-Basado Ca 2 + sondas ha propulsado el campo de Ca 2 + imágenes hacia adelante 16 . Algunos de los GECI existentes son los pares de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) que implican la proteína fluorescente amarilla (YFP), la proteína fluorescente cian (CFP), la calmodulina y el péptido de unión a M13 17 , 18 . Los GECI basados en la troponina C también están disponibles como pares FRET de CFP y citrina y como sondas únicas de fluoróforo 19 , 20 , 21 . Otros, como GCaMP2 y R-GECO son sensores de fluoróforos individuales que implican calmodulina 22 , 23 . Para superar las limitaciones de la afinación estrecha de K d 's y la unión cooperativa asociada con múltiples Ca 2 + vinculante sitios encontrados en su Ca 2 + vinculante dominios [ 24] , una nueva clase de calcio senSors se creó mediante el diseño de un sitio de unión Ca 2 + en la superficie del barril beta en un cromóforo sensible ubicación de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) [ 25 , 26] . Este sensor altamente aclamado, llamado CatchER, tiene un Kd de ~ 0.18 mM, ak pt cerca del límite de difusión, y ak off de 700 s -1 . CatchER se ha utilizado para monitorear receptor mediada ER / SR liberación de calcio en diferentes líneas de células de mamíferos como HeLa, HEK293 y C2C12 [ 25] . Debido a su rápida cinética, CatchER se utilizó en flexor digitorum brevis (FDB) las fibras musculares de los jóvenes y los viejos amigos Virus B NIH Jackson (FVB) ratones para revelar que más Ca 2 + permanece en el SR después de 2 s de despolarización en el FDB Fibras de los ratones de edad en comparación con la de los ratones jóvenes [ 27] . Para superar su baja fluorescencia a 37 ° C, lo que dificulta sus aplicaciones en imágenes de calcio de mamíferos, Hemos desarrollado una versión mejorada de CatchER llamada CatchER + . CatchER + muestra una fluorescencia mejorada a 37ºC para una mejor aplicación en células de mamífero. Se incorporaron mutaciones adicionales en CatchER para mejorar la termoestabilidad y la fluorescencia a 37 ° C 28 , 29 , para crear CatchER + . CatchER + exhibe un aumento de seis veces en su relación señal / ruido (SNR) sobre CatchER 30 .
Aquí se presentan los protocolos para el cultivo y transfección de células HEK293 y C2C12 con CatchER + y su aplicación para la monitorización de transitorios mediados por receptores ER / SR. Se muestran resultados representativos para CatchER + expresado en células HEK293 tratadas con 4 cmc, CPA y ATP. También proporcionamos un protocolo para determinar el K d in situ de CatchER + en células de mioblastos C2C12 y quaNación de [Ca 2+ ] basal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vivir de una sola célula de imágenes de sondas fluorescentes, como CatchER + , es una técnica eficaz para analizar intrincados ER / SR Ca 2 + procesos de señalización en cada célula en respuesta a los receptores agonistas o antagonistas. Esta técnica también es útil para la obtención de imágenes utilizando múltiples longitudes de onda simultáneamente, como las necesarias para Fura-2 o para capturar imágenes de CatchER + y Rhod-2 conjuntamente para monitorear tanto los cambi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, y una subvención suplementaria NIH FR, BB beca a CM, CDT beca a RG.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
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