Screening Assays for at karakterisere romanen endotel regulerende myndigheder involveret i inflammatorisk reaktion
Summary
Vaskulære endotel styrer stramt leukocyt rekruttering. Utilstrækkelig leukocyt ekstravasation bidrager til menneskers inflammatoriske sygdomme. Det er derfor nødvendigt at designe bedre behandlinger til inflammatoriske lidelser søger roman regulerende elementer i endothelial aktivisering. Her beskriver vi en omfattende metode til at karakterisere romanen endotel regulatorer, der kan ændre leukocyt handel under betændelse.
Abstract
I endothelial lag er afgørende for at opretholde homeostase i kroppen ved at styre mange forskellige funktioner. Regulering af den inflammatoriske reaktion i endothelial lag er afgørende for effektiv bekæmpelse af skadelige input og støtte i inddrivelse af beskadigede områder. Når i endothelial celler er udsat for en inflammatorisk miljø, såsom den ydre del af gram-negative bakterier membran, LPS (LPS), de express opløselige pro-inflammatoriske cytokiner, såsom Ccl5, Cxcl1 og Cxcl10, og udløse den aktivering af det cirkulerende leukocytter. Derudover udtryk af adhæsionsmolekyler E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1 på i endothelial overflade giver mulighed for interaktion og vedhæftning af de aktiverede leukocytter i endothelial lag, og i sidste ende ekstravasation mod det betændte væv. I dette scenario skal i endothelial funktion være stramt reguleret fordi overdreven eller defekte aktivering i leukocyt ansættelse kunne føre til inflammatoriske-relaterede lidelser. Da mange af disse lidelser ikke har en effektiv behandling, skal nye strategier med fokus på det vaskulære lag undersøges. Vi foreslår omfattende assays, der er nyttig til søgning af roman endotel regulatorer, der ændrer leukocyt funktion. Vi analyserer endotel aktivering ved hjælp af specifikke udtryk mål involveret i leukocyt rekruttering (f.eks, cytokiner, kemokiner og adhæsionsmolekyler) med flere teknikker, herunder: real-time kvantitativ polymerase kæde reaktion ( RT-qPCR), western-skamplet, flow flowcytometri og vedhæftning assays. Disse tilgange bestemme endotelfunktion i forbindelse med inflammatoriske og er meget nyttigt at foretage screening-assays for at karakterisere romanen endotel inflammatoriske lovgivere, der er potentielt værdifulde for at designe nye terapeutiske strategier.
Introduction
Inflammation er en gavnlig biologisk reaktion mod smitsomme agenser, med det vigtigste mål at eliminere patogenet og reparere beskadiget væv. Under visse betingelser, såsom kroniske infektioner eller autoimmune sygdomme, kan betændelse ikke fortolkes. Der er derimod en afvigende reaktion med kontinuerlig infiltration af leukocytter, hvilket resulterer i en langvarig immunrespons, der fører til vævsskader, fibrose, tab af funktion, og den samlede, handicap og i nogle tilfælde døden af patienten. Disse menneskers lidelser, katalogiseret som inflammatoriske sygdomme, alle involverer blodkar til kontrol af leukocyt ekstravasation1,2.
I endothelial celler spille en grundlæggende rolle i reguleringen af det inflammatoriske respons ved at kontrollere leukocyt handel. Når i endothelial lag er udsat for inflammatoriske mediatorer som LP’ER, hvilende endotelet aktiveres og udtrykker pro-inflammatoriske cytokiner (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) og adhæsionsmolekyler (E-selectin, VCAM-1 og ICAM-1) at favor rekruttering af det cirkulerende leukocytter til webstedet infektion. Leukocytter primet af de frigivne cytokiner derefter mægle rullende og interaktion med i endothelial lag gennem de korrespondent selvklæbende modstykker: PSGL-1 til selectin, α4β1 integrin til VCAM-1 og αLβ2 integrin til ICAM-1. Endelig, leukocytter migrere over Vaskulaturen mod betændelse3fokus.
Den vigtige rolle af endotel i reguleringen af det inflammatoriske respons er påvist på mus, der var genetisk modificeret til at udtrykke LP’ER receptor, toll-lignende receptor 4 (TLR4), kun på endotelceller. Disse endotel-TLR4 dyr var i stand til at reagere på en LPS-medieret betændelse og opdage infektionen genereret efter bakterier podning, og dermed opnå infektion opløsning og overlevelse på nogenlunde samme niveau som vildtype mus4 , 5.
For pathway endotel-regulerede inflammatorisk reaktion har været postuleret at hæmning på visse stadier af leukocyt-endotelet interaktion ville resultere i en reduktion af trans-endotel migration og en bedre prognose for inflammatoriske-relaterede sygdomme. Faktisk er flere strategier rettet mod endotel aktivering og leukocyt-endotelet samspillet designet til at hindre ekstravasation af immunceller som en behandling af inflammatoriske lidelser6,7.
I denne rapport beskriver vi en grundig gruppe af in vitro- teknikker til fuldt ud at beskrive den endotel aktivitet som svar på inflammatoriske stimulus LP’ER og dens rolle i leukocyt aktivering og vedhæftning til den vaskulære lag. Endotel celle model bruges i dette håndskrift var mus lunge endotel cellelinje (MLEC-04), som beskrevet af Hortelano et al. 8. the MLEC-04 cellelinie er blevet valideret i litteraturen til at være et passende system til at studere endotel aktivering9,10. Baseret på forskningsmæssige interesser, disse tilgange kan nemt ekstrapoleres til enhver endotel eller leukocyt systemer og inflammatoriske profil. Når i endothelial parametre i de valgte betingelser er defineret, kan systemet teste nye lægemidler på de foreslåede eksperimenter til at evaluere den vaskulære aktivering. I den inflammatoriske forbindelse, endotel celler testet med sammensatte af interesse kan sammenlignes med kontrol betingelser af cellerne, og eventuelle deraf følgende forskelle kan underrette lægemidlets prognostiske resultatet på udvikling og progression af betændelse. Afslutningsvis foreslår vi et relevant system til at karakterisere nye stof mål til i endothelial celler, som kan påvirke udformningen af roman kar-specifikke behandlinger mod inflammatoriske-relaterede sygdomme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne endotel protokol beskriver en trinvis teknologi, der fastlægger grundlaget for at udforske nye mekanismer involveret i reguleringen af det inflammatoriske respons. Disse tilgange er baseret på undersøgelse af i endothelial aktivitet stimuleres af LP’ER og vurdere de kritiske trin involveret i leukocyt ansættelse under den inflammatorisk respons, specifikt: endotel cytokiner frigivelse, endotel vedhæftning molekyler udtryk og leukocyt adhæsion til det vaskulære lag. Når der i endothelial parametre er oprette…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) og Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (grant nummer IERPY 1149/16 til A.L.; MPY 1410/09 til S. Hortelano); af MINECO gennem Fondo de Investigación da Salud (FIS) (tilskud numre PI11.0036 og PI14.0055 til S. Hortelano). S. Herranz blev støttet af IERPY 1149/16 fra ISCIII.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
Referências
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
