Questo lavoro descrive un metodo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. La preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio durante lo sviluppo neurale.
La creazione di circuiti neuromuscolari funzionali si basa su precisi collegamenti tra assoni motori in sviluppo e muscoli target. I neuroni motori estendono i coni di crescita per navigare lungo percorsi specifici rispondendo a un gran numero di segnali di guida dell'assone che emanano dall'ambiente extracellulare circostante. Il riconoscimento del bersaglio di cono di crescita inoltre svolge un ruolo fondamentale nella specificità neuromuscolare. Questo lavoro presenta un protocollo immunohistochemistico standard per visualizzare le proiezioni dei neuroni motori degli embrioni di Drosophila melanogaster a tarda fase 16. Questo protocollo comprende alcuni passaggi chiave, tra cui una procedura di genotipizzazione, per ordinare gli embrioni mutanti desiderati; Una procedura di immunostaining, per etichettare gli embrioni con l'anticorpo fasciclin II (FasII); E una procedura di dissezione, per generare preparazioni filettate da embrioni fissi. Le proiezioni dell'assone motorio e le forme muscolari della periferia sono molto meglio visualizzate in preparazioni piatte di embrioni di filetti che in whOle-mount embrioni. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi macchiati con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per caratterizzare i geni richiesti per la ricerca del percorso dell'assone motore e il riconoscimento del bersaglio e può anche essere applicato sia a schermi genetici di perdita di funzionalità e di guadagno di funzionalità .
Collegamenti precisi e selettivi tra gli assi del motore e i muscoli target durante lo sviluppo embrionale sono essenziali per la normale locomozione nelle larve Drosophila . Il pattern embrionale di 30 fibre muscolari in ciascuno dei due emisegmenti addominali A2-A7 è stabilito dalla fase 16 1 . I 36 neuroni motori generati nel cavo del nervo ventrale estendono gli assoni nella periferia per innervare i muscoli specifici 2 . Il percorso dell'assonamento del motore e il riconoscimento del bersaglio possono essere visualizzati mediante immunohistochemistry con un anticorpo (anticorpo monoclonale del mouse 1D4) 3 , 4 . Sono disponibili molteplici immagini dei motori di proiezione dell'assone motore in embrioni di tipo selvatico sul web 5 . L'anticorpo 1D4 etichetta tutti gli assoni motori e tre fascette longitudinali di assoni su ciascun lato della linea mediana del sistema nervoso centrale embrionale (CNS) 4 </sUp> , 6 ( Figura 1C e Figura 2A ). Pertanto, immunohistochemistry con FasII anticorpo fornisce un potente strumento per identificare i geni necessari per la connivenza neuromuscolare per dimostrare i meccanismi molecolari alla base di guida axon motore e riconoscimento target.
In ciascuno degli emisferi addominali A2-A7, gli assi del motore si disegnano e selettivamente fascicolano in due rami nervose principali, il nervo segmentale (SN) e il nervo intersegmentale (ISN) 2 , 4 e un ramo nervoso minore, il nervo trasversale (TN ) 7 . La SN defascicola in modo selettivo per dare origine a due rami nervosi denominati SNa e SNC, mentre l'ISN si divide in tre rami nervosi denominati ISN, ISNb e ISNd 2 , 4 . Tra questi, ISN, ISNb e SNA motor axonI modelli di proiezione sono mostrati in modo più preciso quando gli embrioni a tarda fase 16 sono macchiati con FasII e sono filettati ( Figura 1C e Figura 2A ). I neuroni motori ISN estendono i loro assoni per innervare i muscoli dorsali 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 e 20 2 , 4 ( Figura 2A ). I neuroni motori ISNb innervano i muscoli ventrolaterali 6, 7, 12, 13, 14, 28 e 30 2 , 4 ( Figura 2A e 2B). Il ramo nervo SNa proietta innervare i muscoli laterali 5, 8, 21, 22, 23 e 24 2 , 4 ( Figura 2A ). Il TN, costituito da due assi motori, proietta ipsilateralmente lungo il bordo segmentale per innervare il muscolo 25 e fa sinapsi con il neurone dendritico bipolare laterale (LBD) nelPeriferia 7 ( figura 2A ). Queste innervazioni muscolari del bersaglio richiedono non solo la defasciculazione selettiva di assoni motori a punti specifici di scelta ma anche il riconoscimento muscolare. Inoltre, alcune cellule di guidepost mesodermiche putative che fungono da bersagli intermedi sono state trovate sia nei percorsi ISN che SNa, ma non lungo il percorso ISNb 4 . Ciò potrebbe suggerire che l'indirizzamento dell'asse axon del motore ISNb può essere regolato in maniera distinta rispetto alla guida dell'assone motore ISN e SNa e indica anche che la guida per l'asse del motore periferico fornisce un attraente modello sperimentale per studiare i ruoli differenziali o conservati di una singola indicazione di guida Molecola 8 .
Questo lavoro presenta un metodo standard per visualizzare gli schemi di proiezione axon dei neuroni motori embrionali de Drosophila . I protocolli descritti includono come disseccare gli embrioni fissi macchiati con 1D4 aE trasformato in 3,3'-diaminobenzidina (DAB) per preparazioni di filetti. Un vantaggio critico delle preparazioni piane di embrioni fissi è la migliore visualizzazione delle proiezioni assonali e dei modelli muscolari nella periferia. Inoltre, questo lavoro mostra anche come genotipare gli embrioni fissi per ordinare gli embrioni mutanti desiderati utilizzando il metodo di colorazione LacZ.
I dettagli dei difetti di guida dell'assone motorico sono segnati più velocemente e con maggiore precisione dalla preparazione filettata di embrioni macchiati da DAB che dalla scansione laser di microscopia confocale di etichette fluorescenti. Pertanto, la preparazione filettata di embrioni fissi e 1D4 è più adatta per la caratterizzazione funzionale delle molecole di cue di guida. Quattro grandi classi di indici di orientamento, compresi i netrini, i fessure, i semafori (Semas) e le efrine e i loro recettori cog…
The authors have nothing to disclose.
Ringrazio Alex L. Kolodkin, mentre ho imparato questo protocollo di preparazione filato nel suo laboratorio. Ringrazio anche Young Gi Hong per l'assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto da NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
Agar | US Biological | A0930 | |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |