Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.
El establecimiento de circuitos neuromusculares funcionales se basa en conexiones precisas entre los axones motores en desarrollo y los músculos diana. Las neuronas motoras extienden los conos de crecimiento para navegar a lo largo de caminos específicos, respondiendo a un gran número de guías de orientación del axón que emanan del entorno extracelular circundante. El reconocimiento del blanco del cono de crecimiento también juega un papel crítico en la especificidad neuromuscular. Este trabajo presenta un protocolo de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. Este protocolo incluye algunos pasos clave, incluyendo un procedimiento de genotipado, para clasificar los embriones mutantes deseados; Un procedimiento de inmunotinción, para marcar los embriones con el anticuerpo fasciclin II (FasII); Y un procedimiento de disección, para generar preparaciones en filetes a partir de embriones fijos. Las proyecciones axonales motoras y los patrones musculares en la periferia se visualizan mucho mejor en preparaciones planas de embriones fileteados que en whOle-mount embriones. Por lo tanto, la preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la detección del axón motor y el reconocimiento de diana, y también puede aplicarse tanto a las pantallas genéticas de pérdida de función como de ganancia de función .
Las conexiones precisas y selectivas entre los axones motores y los músculos diana durante el desarrollo embrionario son esenciales para la locomoción normal en larvas de Drosophila . El patrón embrionario de 30 fibras musculares en cada uno de los hemisegments abdominales A2-A7 se establece por la etapa 16 1 . Las 36 neuronas motoras que se generan en el cordón nervioso ventral extienden sus axones hacia la periferia para inervar los músculos diana específicos 2 . La detección del axón motor y el reconocimiento del objetivo se pueden visualizar mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo (anticuerpo monoclonal de ratón 1D4) 3 , 4 . Múltiples imágenes de los patrones de proyección del axón motor en embriones de tipo salvaje están disponibles en la web 5 . El anticuerpo 1D4 etiqueta todos los axones motores y tres fascículos axónicos longitudinales en cada lado de la línea media del sistema nervioso central embrionario (SNC) 4 </sUp> , 6 ( Figura 1C y Figura 2A ). Por lo tanto, la inmunohistoquímica con el anticuerpo FasII proporciona una poderosa herramienta para identificar los genes necesarios para la conectividad neuromuscular para demostrar los mecanismos moleculares subyacentes axón motor orientación y reconocimiento de objetivos.
En cada uno de los hemisegmentos abdominales A2-A7, los axones motores se proyectan y se fasciculan selectivamente en dos ramas nerviosas principales, el nervio segmentario (SN) y el nervio intersectorial (ISN) 2 , 4 , y una rama nerviosa menor, el nervio transversal ) 7 . El SN defascicula selectivamente para dar lugar a dos ramas nerviosas llamadas SNa y SNc, mientras que el ISN se divide en tres ramas nerviosas llamadas ISN, ISNb e ISNd 2 , 4 . Entre ellos, ISN, ISNb, SNA y el axón motorLos patrones de proyección se visualizan con mayor precisión cuando los embriones de etapa 16 tardía se tiñen con anticuerpo FasII y se filetean ( Figura 1C y Figura 2A ). Las neuronas motoras ISN extienden sus axones para inervar los músculos dorsales 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 y 20 2 , 4 ( Figura 2A ). Las neuronas motoras ISNb inervan los músculos ventrolaterales 6, 7, 12, 13, 14, 28 y 30 2 , 4 ( Figura 2A y 2B). La rama nerviosa SNa proyecta inervar los músculos laterales 5, 8, 21, 22, 23 y 24 2 , 4 ( Figura 2A ). El TN, que consiste en dos axones motores, proyecta ipsilateralmente a lo largo del borde segmentario para inervar el músculo 25 y hace sinapsis con la neurona dendrítica bipolar lateral (LBD) en elPeriferia 7 ( figura 2A ). Estas innervaciones musculares objetivo requieren no sólo la defasciculación selectiva de los axones motores en puntos específicos de elección, sino también el reconocimiento del músculo objetivo. Además, algunas putativo mesodermal guidepost células que actúan como objetivos intermedios se encontraron tanto en el ISN y SNa vías, pero no a lo largo de la vía ISNb [ 4] . Esto podría sugerir que ISNb motor axon pathfinding puede ser regulado de una manera distinta en comparación con la ISN y SNa axón motor guía, y también indica que periféricos axón motor guía proporciona un atractivo modelo experimental para estudiar el diferencial o conservado funciones de una sola guía de referencia Molécula 8 .
Este trabajo presenta un método estándar para visualizar los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias pt Drosophila . Los protocolos descritos incluyen cómo diseccionar embriones fijos teñidos con 1D4 aNtibody y procesados en 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para preparaciones en filetes. Una ventaja crítica de las preparaciones planas de embriones fijos es la mejor visualización de las proyecciones axonales y patrones musculares en la periferia. Además, este trabajo también muestra cómo el genotipo de embriones fijos para ordenar los embriones mutantes deseados utilizando el método de tinción LacZ.
Los detalles de los defectos de orientación del axón motor se anotan más rápido y con mayor precisión por la preparación en filetes de los embriones teñidos con DAB que por la microscopía confocal de escaneo con láser de los marcados fluorescentemente. Por lo tanto, la preparación en filetes de embriones fijos y teñidos con 1D4 es la más adecuada para la caracterización funcional de moléculas de guía. Cuatro clases principales de señales de guía, incluyendo netrinas, hendiduras, semaforinas (Semas), y e…
The authors have nothing to disclose.
Agradezco a Alex L. Kolodkin, ya que aprendí este protocolo de preparación en filetes en su laboratorio. También doy las gracias al joven Gi Hong por su asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por NRF-2013R1A1A4A01011329 (SJ).
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | t-Octylphenoxypolyethoxyethanol |
16% Paraformaldehyde Solution | Ted Pella | 18505 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 30435 | |
Sodium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 71500 | |
X-Gal Substrate | US Biological | X1000 | X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside) |
Dimethyl Sulfxide | Sigma-Aldrich | D4540 | |
Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate | Sigma-Aldrich | P9387 | |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma-Aldrich | 244023 | |
Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich | 216763 | |
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | D5905 | |
Agar | US Biological | A0930 | |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate) | Sigma-Aldrich | H5501 | |
Culture Dish (60 mm) | Corning | 430166 | |
Tricon Beaker | Simport | B700-100 | This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection. |
Yeast | Societe Industrielle Lesaffre | Saf Instant Yeast Red | |
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100) | VWR | 14220-263 | |
Eppendorf Tube (1.5 ml) | Sarstedt | #72.690 | |
Bleach | The Clorox Company | Clorox | |
Heptane | Sigma-Aldrich | 246654 | |
Methanol | J.T. Baker | UN1230 | |
Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210-064 | |
Anti-FasciculinII Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4 anti-Fasciclin II | |
Goat Anti-mouse-HRP Antibody | Jackson Immunoresearch | 115-006-068 | AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
Slide Glass | Duran Group | 235501403 | |
Coverslip | Duran Group | 235503104 | 18 x 18 mm |
1 ml Syringe | Becton Dickinson Medical(s) | 301321 | |
Tungsten Needle | Ted Pella | #27-11 | Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.) |
Nutator (Mini twister) | Korean Science | KO.VS-96TWS | Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125) |