Характеризующие функцию одоранта рецепторов служит неотъемлемым элементом в процессе deorphanization. Мы описываем метод измерения активацию рецепторов одоранта в режиме реального времени, используя лагеря пробирного.
Огромные размеры млекопитающих одоранта рецептор (OR) семей нынешних трудностей найти их родственных лигандам среди многочисленных летучих химических веществ. Чтобы эффективно и точно deorphanize ПРС, мы совмещаем использование гетерологичных клеточной линии выразить млекопитающих СПР и плазмида генетически модифицированных биосенсора для измерения лагеря производства или активации в режиме реального времени. Этот assay может использоваться для экрана отдушки против СПР и наоборот. Позитивные одоранта рецептор взаимодействия с экранов могут быть впоследствии подтверждены тестирование против различных концентрациях запах, генерации концентрация реакция кривых. Здесь мы использовали этот метод для выполнения высокопроизводительного скрининга пахучие соединения против человека или библиотека выражена в Hana3A клетках и подтвердил, что положительно отвечать рецептор родственных рецептор для соединения интереса. Мы нашли этот метод обнаружения высокой пропускной способностью, чтобы быть эффективной и надежной оценки или активации и наши данные представляют собой пример ее возможного использования в или функциональные исследования.
Обоняние играет важную роль в выживании животных как они полагаются на их обонятельные способности получить пищу, избежать хищников и опасности, различать виды и выберите мат1,2. Реализация этих функций зависит от рецепторов одоранта (СПР), которые выражаются в отдельности на поверхности цилиарной обонятельной сенсорных нейронов (OSNs) расположен в обонятельного эпителия (OE). СПР составляют крупнейший семейство рецепторов (GPCR) надсемейства G-белка в сочетании с приблизительно 400 и 1200 различных или генов человека и мыши, соответственно3,4,5. СПР, активированную отдушки ведут к повышению внутриклеточного уровня лагеря через последовательное активации обонятельных G-белка (ФООG) и тип III adenylyl циклазы (ACIII). Результате повышенный уровень внутриклеточного лагерь может функционировать как второй messenger, который открывает нуклеотида закрытый канал на поверхности клеток, вызывая приток катионов включая Ca2 + и потенциалы действия и в конечном итоге инициирование Нейро потенциал передачи и обонятельные восприятия. Процесс обнаружения и дискриминацию большое количество отдушки, ORs рассматривается в качестве первого шага обонятельных восприятие6,7.
Поскольку первый бак и Аксель8 успешно клонирован одоранта рецепторов и выяснены механизм восприятия обоняния, инициированных ORs, deorphanization или семьи стал одним из горячих точек в этой области. Различные методы в vivo, ex vivo и in vitro для измерения или активации были сообщил9,10,,1112. Традиционный метод, который используется Ca2 + изображения следуют одной ячейки ПЦР-на OSNs включено выявление различных ORs алифатических отдушки13,14,15. Совсем недавно с появлением крупномасштабных транскриптом анализ способствовал развитию более высокой пропускной способностью в vivo методов. Кентукки пробирного определены ORs эвгенол и отзывчивым Мускон мыши с использованием S100a5-tauGFP репортер мыши деформации и microarray анализ9. Основываясь на снижение уровня мРНК или после экспозиции одорант, мечта технология используется транскриптомики подход, чтобы определить или активации профили в обоих видов позвоночных и не позвоночных16. Аналогичным образом учитывая фосфорилирование S6 в нейрональных активаций, Мацунами группы виртуализированного мРНК из фосфорилированных рибосома immunoprecipitations для идентификации реагировать ORs12. Наконец группе Файнштейн сообщил супер снифер мышей, которые могли бы служить в качестве платформы для изучения запах кодирования в естественных условиях, известный как MouSensor технология17.
В realm в пробирке проблема культивирования OSNs делает гетерологичных выражение системы, которая имитирует или функциональных выражение в vivo идеальное решение для проведения крупномасштабных скрининг пахучих химических веществ для ОРС. Тем не менее поскольку искусственный клеточных линий не обонятельных происхождения отличаются от родной OSNs или белки сохраняются в эндоплазматический ретикулум и не в состоянии движения к плазматической мембраны, что приводит к или деградации и потери функции рецепторов18 , 19. для решения этой проблемы, обширные работы были сделаны для репликации или функциональных выражение на клеточной мембране в гетерологичных клеточных линий. Krautwurst et al. сначала придает первые 20 аминокислот родопсина (Ро тег) N-стержня или белка, и это способствовало клетк поверхности выражение некоторых ОРС в клетки человеческого эмбриона почек (ГЭС)20. Путем проведения последовательного анализа ген выражение (SAGE) библиотека анализа от одного OSNs, Сайто и др. Первые клонированные транспортировки рецептор белков (RTP) членов семьи, RTP1 и RTP2 и рецепторы трансферина выражение усилитель 1 (REEP1), или людьми с клеточной мембраны и повысило одоранта опосредованной ответы ORs в HEK293T клетках 21. Основываясь на этих выводах, Мацунами группа успешно создана линия клеток Hana3A, стабильно transfected сФОО RTP1, RTP2, REEP1 и Gα в HEK293T и временно transfected с меткой Ро СПР, для эффективного или функциональных выражение. Последующие исследования показали 1) короче форма RTP1, RTP1S, могли бы более энергично содействовать или работать чем оригинальный RTP1 белка и 2 тип 3 мускариновых ацетилхолиновый рецептор (M3R), которые могли бы укрепить деятельность или через ингибитирование β-arrestin-2 вербовка, оба из которых были введены к системе гетерологичных выражение для оптимизации экспериментальный выход22,23.
Некоторые методы обнаружения были использованы для количественной оценки активации рецептора в гетерологичных систем. Assay секретируемые плацентарной щелочной фосфатазы (СЕАП) работает с репортером фермента транскрипционно регулируется лагеря ответ элементов (КРЕС), что делает его привлекательным вариантом для оценки или активации. Флюоресценция легко обнаруживается в выборке из питательной среды после инкубации с СЕАП обнаружения реагент24. С помощью этого метода, функции СПР, а также среднего класса влагалище рецепторов, выраженная в OE-трассировки, которые Амин связанные рецепторы (TAARs) были охарактеризованы25,,2627. Другой общий метод, Люцифераза assay, использует Светлячок Люцифераза Репортер ген под контролем лагеря ответ элемента (КРР). Измерения люминесценции, порожденных Люцифераза производства обеспечивает эффективные и надежные средства количественного или активации10,11,28.
Реальном времени лагеря анализов также широко используется в динамически мониторинг функции гетерологичных или эндогенных GPCR. Одним из примеров таких передовых анализов использует генетически закодированный биосенсор вариант, который обладает сплавили мутантные формы Люцифераза домен лагерь привязки. Когда лагерь связывает, конформационные изменения приводит к активации Люцифераза, люминесценции, из которого затем может быть измерена с хемилюминесценции читателя29,30. Реального времени лагеря технологии было сообщено подходит для исключения из сирот человека одоранта рецепторы в клетках 108CC15 HEK293 и NxGпопка = «внешней» > 31,,3233, как хорошо, как и HEK293T-производные Hana3A клетки34,35. Krautwurst группа также подробно описано в реальном времени лагеря технологии пригодны для двунаправленного крупномасштабных или отбора подходы32,33.
Здесь мы описываем протокол для измерения или активации с помощью реального времени пробирного лагеря в Hana3A клетках. В этом протоколе люминесценция предварительно уравновешенной живых клеток измеряется кинетически 30 мин после лечения с конкретными летучих соединений, представляющих более эффективный и точный анализ или активации, которые менее чувствительны к артефакты, возникающие в клеточной среды с длительное время и запах индуцированной клеток токсичности. Это измерение в реальном времени позволяет для крупномасштабных скрининг СПР и лигандами, а также характеристика конкретных пар или лиганд интерес. С помощью этого метода, мы успешно определили OR5AN1 как рецептор для составных Мускон мускус, выполняя скрининг против 379 людские ORs и впоследствии подтверждающий результат положительный скрининга.
Точного измерения или активации под воздействием определенных одоранта является первым шагом в расшифровке кодирование обонятельной информации. Экспериментов показано в этом исследовании представляют пример того, как можно определить, используя в пробирке или выражение систем…
The authors have nothing to disclose.
Работа была поддержана Китайский Национальный научный фонд (31070972), Наука и технологии Комиссии Шанхае муниципалитет (16ZR1418300), программа для новаторских исследований команда из Шанхая муниципального образования Комиссии, Восточной Шанхай Программа (J50201) и программа национальных базовых исследований Китая (2012CB910401).
Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
DMSO | Sigma | D2650 | |
FBS | Gibco | 10099-141 | |
GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
Hana3A cells | available from authors upon request | ||
HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride | GIBCO | 14175095 | |
HEPES | Hyclone | SH30237 | |
Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
MEM, w/EBSS and w/L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
PBS, w/o calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
Puromycin | Sigma | P8833 | |
RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
Cell culture incubator, w/ 5% CO2 | |||
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
Spectrophotometer | |||
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
Sterile paper towel |