Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme
Summary
Deterjan çözünmez protein toplamları–dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış Ayırma Protokolü tanımlanır.
Abstract
Bu çalışmada, deterjan çözünmez protein toplamları–dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme için bir kısaltılmış tek adım Ayırma Protokolü açıklar. İyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) etkin bir şekilde beyin dokusu gibi deterjan çözünmez protein toplamları nörodejeneratif proteinopathies, geniş bir dizi zenginleştirme sağlayan yerel olarak katlanmış proteinlerin solubilizes Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı ve amyotrofik lateral skleroz ve prion hastalıkları. İnsan kontrolü ve reklam ölüm sonrası beyin dokuları ultrasantrifüj patolojik fosforile tau, neurofibrillary temel bileşenidir dahil olmak üzere deterjan çözünmez protein toplamları zenginleştirmek için sarkosyl huzurunda tarafından homojenize ve posalı düğüm reklam. Western Blot toplanan fosforile tau ve deterjan çözünür protein, erken Endosome antijen 1 (EEA1) kontrolü ve reklam beyin farklı çözünürlük gösterdi. Proteomik çözümleme Ayrıca βzenginlik ortaya-amiloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 – 70 K) ve apolipoprotein E (APOE) bu kontrol, önceki doku ayırma stratejileri ile tutarlı göre reklam beyin sarkosyl çözünmez kesirler . Böylece, bu basit zenginleştirme Protokolü deneysel uygulamalar Western Blot ve fonksiyonel proteini ortak toplama deneyleri kütle spektrometresi tabanlı proteomik kadar geniş bir yelpazede için idealdir.
Introduction
Nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD), amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve yakından ilgili prion hastalıkları gibi yavaş yavaş birikimi ile karakterize proteinopathies vardır deterjan çözünmez protein toplamları ile bilişsel birlikte beyin reddedin. 1 , 2 bu paylaşılan patolojik özellik etyoloji ve bu nörodejeneratif hastalıklar Patofizyoloji merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir. 2 bu toplamları liflerinin misfolded protein βsergilenmesi birim yinelenen oluşan polimer amiloid, genellikle-yapısı. 1 , 2 , 3 , 4 biyokimyasal olarak, amiloid toplamları kimyasal veya termal denatürasyon ve solubilization, onların arıtma, analiz için benzersiz zorluklar sunar3 son derece dayanıklıdır ve geleneksel biyokimyasal teknikleri ile çalışma. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 şaşırtıcı olmayan bir şekilde, deterjan çözünmez protein fraksiyonu nörodejeneratif hastalıklar misfolded proteinleri birikimi ile ilgili Patofizyoloji içine çok araştırma odağı olmuştur. 6 , 12 , 13 , 14
Biyokimyasal ayırma teknikleri kez ölüm sonrası beyin homogenates dan deterjan çözünmez kesir zenginleştirmek için kullanılmıştır. 6 , 12 , 13 , 14 en yaygın yöntemlerden birini doku homogenates ile tampon sıralı çıkarma ve sıkılık çözünür ve çözünmez kesirler bölme ultrasantrifüj tarafından takip, artan deterjanlar içerir. Yaygın olarak kullanılan sıralı Ayırma Protokolü6,14 donmuş doku örnekleri bir deterjan-Alerjik düşük tuz (LS) arabelleği homojenizasyon içerir ve sonuç çözünmez granül sonra sırayla ile ayıklanır yüksek tuz, non-iyonik deterjanlar, yüksek Sükroz içeren arabellekleri, üre iyonik deterjanlar ve nihayet chaotropes gibi. 6 , 14 önemli ölçüde zaman ve emek taahhüt bunları tamamlamak için gereken böyle bir sıralı ayırma iletişim kuralları belli bir dezavantajı var. Homojenizasyon ve ultrasantrifüj de dahil olmak üzere, tipik beş adım Ayırma Protokolü saat veya bile birkaç alabilir gün tamamlamak için. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 Ayrıca, çok sayıda patolojik protein toplamları kalır en sert koşullar19,20 hariç hepsi çözünmez oluşturulan kesirler çoğu sınırlı değeri. Böylece, yüksek tuz konsantrasyonları ve non-iyonik deterjanlar kullanarak daha az sıkı ayırma adımları büyük ölçüde gereksizdir.
Önceki çalışmalarda iyonik deterjan N-loril-sarcosine (sarkosyl) basitleştirilmiş tek adım deterjan Ayırma Protokolü için mükemmel bir aday olduğunu göstermiştir. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 denaturing bir deterjan olarak sarkosyl beta-amiloid (Aβ),6,11 oluşan misfolded protein toplamları çözücü olmadan yerel olarak katlanmış proteinlerin beyinde büyük çoğunluğu solubilize için sıkı fosforile tau (pTau),6 TAR DNA’ya bağlanıcı protein 43 (TDP-43),14 Alfa-synuclein,12,13 büyük,23 veya U1 küçük nükleer ribonucleoproteins (U1 snRNPs) gibi U1 – 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl her yerde Anyonik deterjan Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) daha az sıkı olduğu için daha az sağlam oligomeric formları SDS tedavi dayanıklı olamaz misfolded protein toplamları korur. 9
Daha önce biz sonuçları daha zahmetli sıralı ayırma yöntemleri için karşılaştırılabilir elde kısaltılmış bir deterjan-Ayırma Protokolü nitelendirdi. 5 daha az sıkı ayırma adımları ihmal olarak, deterjan çözünmez protein toplamları üzerinden öldükten sonra insan beyni zenginleştirme için facile tek adım Ayırma Protokolü geliştirmeye başardık. 5 burada açıklanan bu ayrıntılı iletişim kuralı deneysel uygulamalar Western Blot arasında değişen geniş bir yelpazesi için son derece uygundur ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik fonksiyonel proteini misfolding ve tohum toplama deneyleri. 5 , 6 , 21
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada biz tanıtmak ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizinden deneyleri misfolding fonksiyonel proteini değişen deneysel uygulamalar çok çeşitli için geçerlidir kısaltılmış bir tek adım deterjan-Ayırma Protokolü tartışmak ve western Blot. 5 , 6 , 7 , 10 Bu metodoloji olduğunu Belki de çoğu zaman nörodejeneratif proteinopathies Alzheimer gibi çalışmak için …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Drs. Jim Lah ve Allan Levey, Emory sevgi Nöroloji, yazarlar yararlı yorumlar ve öneriler için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen finanse edildi hızlanan tıp ortaklık tarafından (U01AG046161-02), Emory Alzheimer’ın hastalığı Araştırma Merkezi (P50AG025688) ve yaşlanma Ulusal Enstitüsü (R01AG053960-01) N.T.S. için erişim izni verme Bu araştırma da kısmen Emory nörolojik NINDS çekirdek İmkanları grant, P30NS055077 nevropatoloji çekirdeği tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| 1.5 ml polypropylene Pellet Pestle | Kimble Chase | 749521-1500 | homogenization tool |
| cordless motor for Pellet Pestle | Kimble Chase | 749540-0000 | homogenization tool |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
Referências
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist’s Perspective. Role in Alzheimer’s and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer’s Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer’s Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer’s disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer’s brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
