Microfluidic דימות זרימת cytometry ידי אסימטרית איתור זמן למתוח אופטי מיקרוסקופית (ATOM)
Summary
פרוטוקול זה מתאר את היישום של זמן א-סימטרי איתור למתוח מערכת מיקרוסקופית אופטית עבור הדמיה תא בודד זרימה microfluidic מהירים ויישומים שלה cytometry זרימת הדמיה.
Abstract
שינוי קנה המידה של מספר פרמטרים מדידים, אשר מאפשר ניתוח נתונים רב ממדית ועל כך גבוהה יותר סטטיסטית תוצאות סטטיסטיות, כבר המגמה העיקרית בפיתוח מתקדם של cytometry הזרימה. יש לציין, הוספת יכולות הדמיה ברזולוציה גבוהה מאפשרת ניתוח מורפולוגי מורכב של מבנים הסלולר / תת הסלולר. זה לא אפשרי עם cytometers זרימה סטנדרטית. עם זאת, הוא בעל ערך לקידום הידע שלנו על פונקציות הסלולר יכול להפיק תועלת מחקר מדעי החיים, אבחון קליני, ניטור סביבתי. שילוב יכולות הדמיה לתוך cytometry זרימת פשרות התפוקה assay, בעיקר בשל מגבלות על מהירות ורגישות בטכנולוגיות המצלמה. כדי להתגבר על מהירות זו או אתגר התפוקה מול cytometry זרימת הדמיה תוך שמירה על איכות התמונה, א-סימטרית איתור זמן למתוח מיקרוסקופית אופטית (ATOM) הוכח לאפשר גבוהה ניגודיות, תא בודד תאעם רזולוציה תת סלולארית, בתפוקת הדמיה עד 100,000 תאים / s. בהתבסס על תפיסת הדמיה של הדמיה קונבנציונאלי זמן למתוח, אשר מסתמך על כל קידוד התמונה אופטי אחזור באמצעות פעימות לייזר מהירים בפס רחב, ATOM עוד התקדמות ביצועי הדמיה על ידי שיפור ניגודיות התמונה של תאים ללא תווית / unstained. מטרה זו מושגת על ידי גישה למידע שלב הדרגתי של התאים, אשר מקודדים spectrally לתוך פעימות יחיד פס רחב. לפיכך, ATOM הוא יתרון במיוחד במדידות תפוקה גבוהה של מורפולוגיה תא בודד ומרקם – מידע המעיד על סוגי תאים, מדינות, ואפילו פונקציות. בסופו של דבר, זה יכול להיות חזק פלטפורמה cytometry זרימת הדמיה עבור phenotyping biophysical של תאים, משלימים את המדינה הנוכחית של ה- Art ביוכימי-סמן מבוסס assay סלולרי. עבודה זו מתארת פרוטוקול כדי לקבוע את המודולים העיקריים של מערכת ATOM (מ Frontend אופטי נתונים pRcessing ו להדמיה backend), כמו גם את זרימת העבודה של זרימת cytometry הדמיה המבוססת על ATOM, באמצעות תאים אנושיים מיקרו אצות כמו הדוגמאות.
Introduction
הדמיה אופטית מציג כלי רב עוצמה assay מבוסס תא כדי (כמעט) לא פולשני לדמיין את ההפצה המרחבית מפורט של רכיבים סלולריים רבים / תת, ובכך לחשוף שפע של מורפולוגי, biophysical, ו biomolecular חתימות של תאים. עם זאת, יכולת זו כדי לחלץ מידע תוכן גבוהה מתאים בודדים נפגע בדרך כלל כאשר האוכלוסייה העצומה והטרוגנית של תאים היה צריך להיחקר. זה מסמן משותף המסחר off-assay מבוסס מבחני בין התפוקה המדידה ותוכן. דוגמה בולטת היא כי הוספת יכולת הדמיה כדי cytometry הזרימה הביאה למטה קנה המידה של התפוקה על ידי לפחות 1-2 סדרי גודל לעומת זה של cytometers הזרימה הקלאסית הדמיה קלאסית. למרות שזה יכול להציע מורכבים ניתוח מורפולוגי יחיד תא זה אינו אפשרי עם cytometers זרימה רגילה 1 , cytometry זרימת הדמיה בדרך כלל חסר התפוקה מספיק מזההמטמיעים הטרוגניות סלולרית עם ביטחון סטטיסטי גבוה. זה הכרחי עבור תגליות חדשות בביולוגיה כדי להשיג הבנה של הפתוגנזה של מחלות. האתגר הטכנולוגי העיקרי טמון במגבלת המהירות הטבועה באסטרטגיות ההדמיה האופטית הנפוצות: סריקת קרן לייזר ( לדוגמה, על ידי מראות גלוונומטריות) ו / או חיישני תמונה ( למשל, מכשיר מצמד טעינה (CCD) תחמוצת תחמוצת (CMOS)). מהירות הסריקה בלייזר מוגבלת באופן מוחלט על ידי האינרציה המכנית של מראות הסריקה, בעוד ששיעור המסגרות של CCD או CMOS מוגבל על ידי הסחר היסודי בין מהירות ההדמיה לבין הרגישות ( כלומר, הגדלת קצב המסגרות גורמת לירידה ברגישות לזיהוי אותות , ולהיפך).
מבוסס על כל אופטי, Ultrafast התמונה קידוד מנגנון, אופטי הזמן למתוח הדמיה הוכח כפלטפורמה אטרקטיבית עבור תפוקה גבוהה זרימה דימות cytOmeters, ללא צורך של חיישנים תמונה קונבנציונאלי או לייזר מכני סריקה 2 , 3 . תיאורים מפורטים של עקרון העבודה של זמן למתוח הדמיה ניתן למצוא בהתייחסויות 4 , 5 , 6 , 7 . בקצרה, הוא מורכב משני שלבי מיפוי הניתנים להחלפה: (i) קידוד ספקטרלי (מיפוי שטח גל), שבו הקואורדינטות המרחביות של הדגימה המצויה ממופות לאורכי גל שונים על פני הספקטרום של קרן אור 8 , 9 , ו – (ii) טרנספורמציה פורייה מפוזר (מיפוי זמן גל) 9 , שבו רכיבים אורך גל של פולסים לייזר בודדים הופכים (מתוח) באמצעות פיזור מהירות הקבוצה (GVD) לתוך גל (שטף גל) גל (גל 1 ) גל ( איור 1 ). חשובתכונה של זמן למתוח הדמיה היא הגברה אופטית, אשר ממלא תפקיד קריטי במאבק אובדן רגישות עקב photodetection מהירים ואת אובדן GVD, ובכך לשפר את יחס אות לרעש תמונה (SNR) מבלי להיות מזוהם על ידי רעש photodetector 9 . מאז כל הדופק לייזר מקודד קו סריקה של הדגימה הדמיה, המהווה אורתוגונלית לזרימה חד כיווני של התאים, קו יעיל לסרוק קו נקבעת על ידי שיעור החזרה לייזר, אשר בדרך כלל מעבר 10 מגהרץ. זה מבצע מהיר מאפשר לטשטש חינם, תא בודד ללכוד תמונה בתפוקה של 10,000-100,000 תאים / s ( כלומר, 10-100 פעמים גבוה יותר מאשר cytometry זרימת הדמיה קונבנציונאלי). כתוצאה מכך, זמן הדמיה יכול למצוא יישומים ייחודיים בתפוקה גבוהה, בודד תא, מבוסס התמונה ההקרנה, במיוחד כאשר יש צורך לזהות הטרוגניות ידוע או תאים נדירים / חריגה בתוך אוכלוסייה ניכרת (אלפי עד מיליוני Cel Ls), כגון נדירים תאי סרטן הקרנה 10 או מיקרו אצה סיווג 11 .
זמן למתוח הדמיה מסתמך בעיקר על שדה בהיר (BF) לכידת תמונה, שממנו בניגוד התמונה נוצרת באמצעות פיזור האור וקליטה מן התאים 2 , 3 , 9 , 10 , 11 . יכולות הדמיה ללא תווית אחת, ללא תא, יכולות לעקוף את ההשפעות המזיקות הקשורות לתוויות הניאון, כגון ציטוטוקסיות ופוטובלאצ'ינג, ועדיין לספק מידע בעל ערך לניתוח תא בודד המבוסס על המרקם והמורפולוגיה התאית והתת-תאית. אלה ללא תווית פרמטרים הוכיחו להיות יעיל עבור סיווג תמונה עמוקה של תאים, במיוחד כאשר אוכלוסיית תאים עצומה זמין 11 ,"Xref"> 12. עם זאת, במקרים רבים, הדמיה BF נכשל לספק ניגוד מספיק כדי לחשוף את המורפולוגיה מפורט של התווית ללא תאים שקופים. תוויות שונות ללא תווית, שלב, בניגוד, זמן למתוח הדמיה פותחו עבור שיפור הניגוד הדמיה בקצב מהיר מסגרת 13 , 14 , 15 . בין הטכניקות הללו, פותח מיקרוסקופיית המיקרוסקופ האופטי-מתיחה האסימטרי-זמן (ATOM) כדי לחשוף את ההשתנות בשלב (הפרש-הפרעות-ניגודיות-ניגודיות) המבוססת על קונספט הדומה לצילום Schlieren, ללא תשלום, הדמיה ניגודיות גבוהה של תאים בודדים במהירות ultraigh microfluidic (עד 10 מ ש) 16 . אפקט זה יכול להיווצר בקלות באמצעות גילוי אלכסוני או תאורה על ידי חסימה חלקית של נתיב קרן מקודד תמונה או הטיה את הקורה לפני photodetection. יתרון נוסף של ATOM הוא שלהכדי לרכוש בו זמנית שני ניגודים פאזה- gradient יחד עם אוריינטציות הפוכה. חיסור אינטנסיביות וסיכום של שתי תמונות מנוגדות ניגודיות מניבות את ההפרש בין השלב ההדרגתי ואת נקודת הניגוד, בהתאמה, מאותו קו סריקה. עבודה זו מציגה פרוטוקול מפורט המתאר את יישום ATOM, כולל הקמת של תוכנית אופטית, הכנת המדגם, ואת רכישת נתונים להדמיה. באופן ספציפי, עבודה זו מדגימה את הפעולה ATOM עם הדמיה תא בודד של תאי דם אנושיים, תאים סרטניים, ו phytoplankton (microalgae). זה מדגיש את תחולתו של ATOM כדי cytometry זרימת הדמיה, לא רק בזירה ביו, אלא גם במחקר ימית דלק ביולוגי 17 , 18 .
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר פרטים טכניים הדורשים תשומת לב מיוחדת במהלך ההתקנה של מערכת ATOM. ראשית, חשוב לציין כי תאורה אסימטרית / אלכסונית בעלת קידוד ספקטרלי עשויה להציג את רכיבי השיפוע השלבי ( כלומר, אפקט הצללה) בקונטקסט הקליטה ולהשפיע על הגדלת הניגוד של פאזה-מעבר ב- ATOM. לכן, אפקט זה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למר פ. יונג על הכנת ה- MCF-7 עבורנו. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי המועצה למענקי מחקר של אזור ההנהלה המיוחדת של הונג קונג, סין (פרויקט מס '17259316, 17207715, 17207714, 17205215 ו- HKU 720112E), תוכנית החדשנות והטכנולוגיה (ITS / 090/14 ), ואת האוניברסיטה לפיתוח קרן של HKU.
Materials
| Nikon Plan Fluorite Physiology Objectives 40X | Nikon | MRF07420 | Objective lens (Obj2) |
| Olympus Plan Fluorite Objective, 0.75 NA, 0.51 mm WD, 40X | Olympus | RMS40X-PF | Objective lens (Obj1) |
| N-BK7 Plano-Convex Lenses | Thorlabs | LA1145-C | For relaying spectral shower |
| FC/APC Fiber Collimation Package | Thorlabs | F220APC-1064 | For outputing and collecting laser pulses |
| Pellicle beamsplitter | Thorlabs | BP145B3 | For making beam replica |
| Protected silver mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | For reflecting light |
| 800-1650nm 12GHz single mode DC-coupled NIR Photoreceiver | Newport | 1544-B | For converting light into electrical signal |
| Infiniium High-Performance Oscilloscope | Agilent | DSOX91604A | To save the light-converted electrical signals |
| HI1060 optical fiber | Corning | HI1060 | Optical fiber for time-stretch |
| YTTERBIUM DOPED FIBER AMPLIFIER | Keopsys | KPS-STD-BT-YFA-37-BO-SM-111-FA-FA | Optical in-line amplifier |
| Holographic grating | Wasatch Photonics | 020305-6 | Grating |
| Infuse/Withdraw Syringe Pumps | Harvard Apparatus | PHD 2000 | Syringe pump for sample loading in micro-fluidic channels |
Referências
- Lau, A. K. S., Wong, T. T. W., Shum, H. C., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K., Barteneva, N. S., Vorobjev, I. A. . Imaging Flow Cytometry: Methods and Protocols. , 23-45 (2016).
- Goda, K., Tsia, K. K., Jalali, B. Serial time-encoded amplified imaging for real-time observation of fast dynamic phenomena. Nature. 458 (7242), 1145-1149 (2009).
- Goda, K., Jalali, B. Dispersive Fourier transformation for fast continuous single-shot measurements. Nat Photon. 7 (2), 102-112 (2013).
- Lau, A. K., Shum, H. C., Wong, K. K., Tsia, K. K. Optofluidic time-stretch imaging – an emerging tool for high-throughput imaging flow cytometry. Lab Chip. 16 (10), 1743-1756 (2016).
- Lau, A. K. S., Tang, A. H. L., Xu, J., Wong, X. W., Y, K. K., Tsia, K. K. Optical Time Stretch for High-Speed and High-Throughput Imaging – From Single-Cell to Tissue-Wide Scales. IEEE J. Sel. Top. in Quant. Electron. 22 (4), (2016).
- Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Appl Phys Rev. 3 (1), 011102 (2016).
- Lei, C., Guo, B., Cheng, Z., Goda, K. Optical time-stretch imaging: Principles and applications. Applied Physics Reviews. 3 (011102), (2016).
- Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
- Goda, K., Solli, D. R., Tsia, K. K., Jalali, B. Theory of amplified dispersive Fourier transformation. Physical Review A. 80 (4), 043821 (2009).
- Goda, K., et al. High-throughput single-microparticle imaging flow analyzer. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (29), 11630-11635 (2012).
- Lai, Q. T. K., et al. High-throughput time-stretch imaging flow cytometry for multi-class classification of phytoplankton. Opt. Express. 24 (25), 28170-28184 (2016).
- Chen, C. L., et al. Deep Learning in Label-free Cell Classification. Sci Rep. 6, 21471 (2016).
- Fard, A. M., et al. Nomarski serial time-encoded amplified microscopy for high-speed contrast-enhanced imaging of transparent media. Biomed Opt Express. 2 (12), 3387-3392 (2011).
- Lau, A. K., et al. Interferometric time-stretch microscopy for ultrafast quantitative cellular and tissue imaging at 1 mum. J Biomed Opt. 19 (7), 76001 (2014).
- Mahjoubfar, A., Chen, C., Niazi, K. R., Rabizadeh, S., Jalali, B. Label-free high-throughput cell screening in flow. Biomed Opt Express. 4 (9), 1618-1625 (2013).
- Wong, T. T., et al. Asymmetric-detection time-stretch optical microscopy (ATOM) for ultrafast high-contrast cellular imaging in flow. Sci Rep. 4, 3656 (2014).
- Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renew Sustainable Energy Rev. 14 (1), 217-232 (2010).
- Irigoien, X., Huisman, J., Harris, R. P. Global biodiversity patterns of marine phytoplankton and zooplankton. Nature. 429 (6994), 863-867 (2004).
- Wei, X., et al. Coherent Laser Source for High Frame-Rate Optical Time-Stretch Microscopy at 1.0 µm. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 20 (5), 384-389 (2014).
- Wei, X., et al. Breathing laser as an inertia-free swept source for high-quality ultrafast optical bioimaging. Opt. Lett. 39 (23), 6593-6596 (2014).
- Xu, Y., Wei, X., Ren, Z., Wong, K. K. Y., Tsia, K. K. Ultrafast measurements of optical spectral coherence by single-shot time-stretch interferometry. Sci Rep. 6, 27937 (2016).
- Tsia, K. K., Goda, K., Capewell, D., Jalali, B. Performance of serial time-encoded amplified microscope. Opt. Express. 18 (10), 10016-10028 (2010).
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Challenges in circulating tumour cell research. Nat Rev Cancer. 14 (9), 623-631 (2014).
- Kling, J. Beyond counting tumor cells. Nat Biotech. 30 (7), 578-580 (2012).
- Hodgkinson, C. L., et al. Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer. Nat Med. 20 (8), 897-903 (2014).
- Ozkumur, E., et al. Inertial focusing for tumor antigen-dependent and -independent sorting of rare circulating tumor cells. Sci Transl Med. 5 (179), (2013).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Scientific Reports. 3, 1259 (2013).
- Karabacak, N. M., et al. marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples. Nat. Protocols. 9 (3), 694-710 (2014).
- Krebs, M. G., et al. Molecular analysis of circulating tumour cells-biology and biomarkers. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 129-144 (2014).
- Wu, J., et al. Ultrafast Laser-Scanning Time-Stretch Imaging at Visible Wavelengths. Light Sci Appl. , (2016).
