Un método de aislamiento de grado clínico novedoso para Stromal células de riñón humano perivasculares

Summary

Aquí presentamos un método de aislamiento y de la cultura de grado clínico novela para riñón células estromales perivasculares (kPSCs) basado en perfusión de órgano entero con enzimas digestivas y células NG2 enriquecimiento. Con este método, es posible adquirir un número suficiente de células para terapia celular.

Abstract

Las células estromales mesenquimales (MSCs) son homeostáticos e inmune modulador las células del tejido que han mostrado efectos beneficiosos en enfermedades de riñón y trasplante. Células del estroma perivascular (PSCs) comparten características con médula MSCs (bmMSCs). Sin embargo, también poseen, probablemente debido a la impresión local, propiedades específicas de tejidos y juegan un papel en la homeostasis del tejido local. Esta especificidad de tejido puede resultar en la reparación de tejidos específicos, también en el riñón humano. Previamente demostramos que PSC de riñón humano (kPSCs) ha mejorado la riñón epitelial de cicatrización mientras que bmMSCs no tenía este potencial. Además, kPSCs puede mejorar lesiones de riñón en vivo. Por lo tanto, kPSCs constituyen una interesante fuente para terapia celular, particularmente para enfermedades renales y trasplante renal. A continuación os mostramos el método de aislamiento y cultura detallado para kPSCs de trasplante grado de riñones humanos basados en perfusión de órgano conjunto de enzimas digestivas a través de la arteria renal y el enriquecimiento para el marcador perivascular NG2. De esta manera, se pueden obtener cantidades grandes de la célula que son adecuados para la terapia celular.

Introduction

Las células estromales mesenquimales (MSCs) son células inmunes moduladores que fueron originalmente aisladas de la médula ósea. Se caracterizan por su eje en forma de morfología, capacidad de diferenciarse en grasa, hueso y cartílago y adhesión de plástico. MSCs expresan los marcadores estromales CD73, CD90, CD105 siendo negativa para los marcadores CD31 y CD45^1,2,3. MSCs están un candidato prometedor para la terapia celular debido a su tejido homeostático y capacidad inmunomoduladora. bmMSCs actualmente se están estudiando en ensayos clínicos para varias enfermedades, incluyendo enfermedades de riñón y trasplante de riñón como revisado en otra parte⁴.

Previamente fue demostrado que perivascular de las células de diferentes órganos sólidos, incluyendo el tejido adiposo, placenta y músculo esquelético comparten características con MSCs⁹. Sin embargo, estas células también presentan funciones específicas de tejidos que pueden resultar en organotypic reparación¹⁰. Las células perivasculares miocardio humano, por ejemplo, estimulan respuestas angiogénicos después de hipoxia y diferenciado en cardiomiocitos, mientras que las células perivasculares aisladas de otros tejidos no mostró estos potenciales¹¹.

Las células del estroma perivascular también pueden ser aisladas del ratón^12,13,14 y^15,de riñón humano¹⁶. Ampliamente había caracterizado kPSCs y comparó a bmMSCs. Se encontró que kPSCs similares a bmMSCs, tienen capacidades inmunosupresoras y puede apoyar la formación del plexo vascular. Sin embargo, hay tejido las diferencias específicas entre los tipos de células, como demostrada una firma de expresión transcripcional organotypic, incluyendo los factores de transcripción nefrógeno HoxD10 y HoxD11 kPSCs. kPSCs, en contraste con bmMSCs, no se someten a transformación de miofibroblastos después del estímulo con TGF-β y eran incapaces de diferenciarse a adipocitos. Además, kPSCs había acelerado integridad epitelial en un ensayo cero riñón herida epitelial tubular, un fenómeno que no se observó con bmMSCs. Esta herida mayor reparación fue mediada a través de la liberación de factor de crecimiento hepatocito. Por otra parte, kPSCs mejoró la lesión renal en un modelo murino de lesión renal aguda¹⁵. Por lo tanto, kPSCs parecen tener capacidades de reparación renal superior y son una interesante fuente nueva para terapia celular en enfermedades renales.

Para poder utilizar kPSCs para fines de terapia celular, kPSCs deben aislarse de manera grado clínico con enzimas de grado clínico y protocolos. Por otra parte, para ser capaces de tratar a varios pacientes con kPSCs de 1 donante, debe obtenerse un número suficiente de células. A continuación os mostramos en detalle, el procedimiento de aislamiento de grado clínico de kPSCs de los riñones de trasplante de todo grado, produciendo un número suficiente de células para ser utilizado por clínica terapia celular.

Protocol

The local medical ethical committee and ethical advisory board of the European consortium (STELLAR) approved the research and collection of human transplant grade kidneys discarded mainly for surgical reasons. Research consent was given for all kidneys. 1. Preparations for Cell Culture Prepare a pool of platelet lysates. Store the platelets that have expired for less than 2 d in -80 °C until use (for a maximum of 1 year). NOTE: The platelets were originally sourced from a commercial vendor. Hospital surplus material distributed by the local blood bank were obtained. Thaw the platelets of at least 5 donors (preferably 10) O/N at 4 °C. Pool the platelets in a large sterile bottle, transfer to conical centrifuge tubes and spin down for 10 min at 1,960 x g at 4 °C. NOTE: The volume of platelets depends on the number of donors and the amount of hospital surplus material per donor. Pipette the supernatant to blood bags (50 mL/bag) through the barrel of a 50 mL syringe. Store at -80 °C. Preparation of cell culture medium. Defrost one bag of platelet lysates in a water bath at 37 °C. Add 1 L (i.e. 2 bottles) of Minimum Essential Medium – alpha modification (alphaMEM), 5 mL 200 mM glutamine, and 20 mL of penicillin (5,000 U/mL)/streptomycin (5,000 µg/mL) (pen/strep) to the bag. Incubate for 3 h at 37 °C. Shake the bag for degelling by gently tapping on the bag when the bag is resting on a flat surface. Filter the 5% platelet lysates medium by pulling the lysates through the filter of the transfusion system with a sterile 50 mL syringe. Aliquot the medium in 50 mL tubes and store in -80 °C until use. NOTE: Every new batch of platelet lysates is tested in cell culture and compared to the previous batch by growing cells of interest (bmMSCs or kPSCs) to confluency in both batches. In cell numbers and viability, the kPSCs or bmMCs grown in the new batch should not differ more than 10%, and the marker expression of CD73, CD90, CD105 and CD31, CD34 and CD45 as analyzed by flow cytometry should not differ. The methods of cell culture are described in section 6 of the protocol (Culture of kPSC). 2. Preparations for Cell Harvest Preparation of solutions. Prepare the plain medium by adding 10 mL of pen/strep to 500 mL (1 bottle) of Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM)-F12. Prepare the washing medium by adding 50 mL of Normal Human Serum (NHS) and 10 mL of pen/strep to 1 bottle of DMEM-F12. Prepare the enzyme-stock buffer by adding 2.9 mL 1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), 1.2 mL NaHCO3 2.5% [w/v] and 160 µL CaCl2 (1 M) to 160 mL University of Wisconsin solution. Prepare the collagenase solution by slowly adding 20 mL of enzyme stock buffer to the bottle of GMP-grade collagenase containing >2,000 U/bottle collagenase. Dissolve at 4 °C for approximately 40 min. Gently shake several times during the dissolving period. Prepare the freeze medium by adding 5 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) to 45 mL NHS. Preparation of perfusion tray (Figure 1A). Clean the flow cabin and cover with surgical drapes. Heat a water bath to approximately 40 – 45 °C to heat the perfusion tray to 37 °C. Put on surgical gowns and surgical gloves. Connect a sterilized perfusion tray to the water bath to preheat the perfusion tray with warm water. Make sure that there is no air in the perfusion tray by starting with the perfusion tray in the vertical position. If necessary add more water to the water bath to prevent air infusion into the perfusion tray. Place the LS25 tube in the pump. Leave both sterile ends of the tube in the flow cabinet. Place a Kocher's forceps on one end of the tube and allow to rest on the bottom of the perfusion tray. Place a sterile gauze on top of the tube to prevent obstruction. Attach a Luer connector on the other tube end. Add approximately 100 mL of plain medium into the perfusion tray and start flushing the tube on a pump speed of 100 mL/min. 3. Kidney Cell Isolation Preparation of the kidney. Remove the kidney from the double sterile bags and place on the sterile perfusion tray (Figure 1B). Remove the perirenal adipose tissue and kidney capsule with scissors and gentle tearing (Figure 1C) and identify the renal artery on the aortic patch as shown in Figure 1D. Cannulate the renal artery with the accessory spike, fix with a sterilized tie-rip, and attach to the pump tube end with the Luer connector while the pump is on. If the tubes are not completely filled, first add more medium to the tray and flush tubes by starting the pump (Figure 1E – F). Flush the kidney with plain medium via the pump with a flow of 100 mL/min. Collagenase treatment and kidney cell isolation. Add collagenase (20 mL, >2,000 U) and DNase (2.5 mL, 1 mg/mL) to the perfusion tray (Figure 1G). Turn the kidney from time to time gently by hand. Wait until the kidney becomes soft and the perfusion liquid becomes less transparent (approximately 30 – 40 min). Gently massage the kidney (Figure 1H) until a cell suspension is obtained (Figure 1I). Remove non-digested material and the spike in the renal artery. Washing and collection of kidney cells. Add 50 mL of the NHS to the cell suspension. Drain the cell suspension from the perfusion tray by putting the pump at low flow and placing the tube first connected to the kidney above the 50 mL tubes (Figure 1J). Centrifuge at 300 x g for 7 min at 4 ˚C and remove the supernatant. Wash the pellets with washing medium containing 10% NHS and again centrifuge at 300 x g for 7 min. Repeat washing once more. Measure the volume of the cell pellets and add an equal volume of cell culture medium. Either cryopreserve the cells from here by adding freezing medium 1:1 to the cell suspension and store in cryogenic vials according to standard protocols, or continue to culture the cells (section 4). NOTE: The cell suspension contains cell clumps and requires extra steps to obtain single cells, which results in an increase in cell death. Therefore, the cells are kept in suspension and are not counted at this stage. 4. Cell Culture of Crude Kidney Cells Add approximately 1 mL of the cell suspension to 24 mL of alphaMEM 5% platelet lysates (cell culture medium) in a T175 cell culture flask (Figure 1K) and culture at 37 °C, 5% CO2. Remove the medium and cell debris after 2 d from the adherent cells and refresh the medium with 25 mL of cell culture medium. Refresh the culture medium twice a week by removing half of the medium (12.5 mL) and adding fresh medium (12.5 mL) using aseptic techniques. Culture until confluent (usually 5 – 7 d) (Figure 1L). Remove the medium, wash twice with PBS and trypsinize the cells by adding 5 mL trypsin to each T175 flask for 5 min at 37 °C. Wash in culture medium and centrifuge at 490 x g for 5 min and remove the supernatant. 5. Cell Enrichment for NG2 by Magnetic Cell Separation (Figure 1M) Prepare the cell separation buffer according to manufacturer's protocol. Resuspend the trypsinized kPSCs in 10 mL cell separation buffer. Centrifuge at 490 x g for 5 min, discard the supernatant and resuspend the cells in 300 µL cell separation buffer. Add 100 µL FcR blocking reagen/5 x 107 cells, add 100 µL anti-melanoma (NG2) beads per 5 x 107 cells, and incubate for 30 min at 4 °C. Separate the NG2-positive fraction according to manufacturer's protocol. Add 10 mL of medium and centrifuge cells for 5 min at 490 x g. Count the cells using a Bürker counting chamber according to manufacturer's protocol. Seed the cells in a culture flask (approximately 4 x 103 cells/cm2) and incubate. NOTE: Seed the cells in the following concentrations: <250,000 in a T25 flask, 250,000 – 500,000 in a T75 flask, and 700,000 – 800,000 in a T175 flask. After magnetic cell enrichment, a positive fraction of approximately 1 – 2% is isolated. However, as this step is cell enrichment and not cell sorting, other cell types will be present in the culture (Figure 1N). After several passages (usually around 4 – 5), only a homogenous kPSC-population is present (Figure 1P). 6. Culture of kPSCs Refresh the medium twice a week by removing half of the medium and replace it with freshly thawed culture medium (Figure 1N). NOTE: The kPSCs tend to be more viable and proliferative when only half of the medium is refreshed. Passaging of kPSCs. NOTE: Passage the kPSCs at either 90 – 100% confluency, or when 3D structures appear (see Figure 1O), or when there hasn't been cell growth for more than a week. The latter two particularly might occur at early passages after cell enrichment. In this case, after passaging, the cells will usually start to grow again in monolayer culture (Figure 1P). Remove the medium from the 90 – 100% confluent cells (keep the medium for later use). Wash the flask twice with PBS (1 mL in T25, 5 mL in T75, 10 mL in T175). Add trypsin (0.5 mL in T25, 2 mL in T75, 5 mL in T175) and incubate for 5 min at 37 °C. Add the old medium to the flask and resuspend gently. Transfer to a 15 or 50 mL tube (depending on the volume) and centrifuge at 490 x g for 5 min. Count the viable cells and plate <250,000 in a T25, 250,000 – 500,000 in a T75, or 700,000 – 800,000 in a T175 (approximately 4 x 103 cells/cm2). Test the kPSCs at passage 5 or 6 (e.g., scratch assay, section 7). NOTE: Characterize the propagated cells by flow cytometry using standard protocols. Marker expression of NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC should all be positive and CD31, CD34, CD45 and HLA-DR should be negative. Test for mycoplasma, bacteria and fungi in the culture medium according to standard protocols of the clinical microbiology lab. Test the kPSCs functionally in a kidney epithelial wound scratch assay. Experiments are usually performed with sterile, flow cytometry-confirmed homogeneous kPSC populations with wound healing capacity between passage 6-8. Cryopreserve the kPSCs by adding 0.5 mL cryopreservation medium to 0.5 mL cell suspension (2 million cells per mL of culture medium) using standard protocols. NOTE: After thawing, seed the kPSCs at a higher density (106 cells in a T175). 7. Functional Test of kPSCs: Kidney Epithelial Wound Scratch Assay Culture the kPSCs in a 6-well plate at a density of 200,000 cells/well in 2 mL culture medium. After 48 h of culture at 37 °C, 5% CO2, collect the supernatant. This is the conditioned medium. Seed the HK-2 (proximal tubular epithelial cells)17 in 2 mL of Proximal Tubular Epithelial Cell (PTEC) medium consisting of a 1:1 ratio of DMEM-F12 supplemented with insulin (5 mg/mL), transferrin (5 mg/mL), selenium (5 ng/mL), hydrocortisone (36 ng/mL), triiodothyrinine (40 pg/mL), epidermal growth factor (10 ng/mL) and pen/strep, in a density of 500,000 cells per well in a 6-well cell culture plate. Culture for 48 h at 37 °C, 5% CO2. Remove the cell culture medium of the HK-2s and create a scratch wound in the monolayer of HK-2s by making a scratch with the tip of a yellow pipette point from the top to the bottom of the well. Wash the HK-2s with PBS and add the conditioned medium of the kPSCs or control medium. Mark on the bottom of the plate the area to be imaged. NOTE: The HK-2s should be confluent. Image two areas per well. Image the scratch at 4, 8, 12 and 24 h at the same marked position with an inverted bright-field microscope. Measure the scratch area in Image J using the polygon selection tool to determine the percentage of closure.

Representative Results

El método de aislamiento de kPSCs de grado clínico se resume en la figura 1. Las células del riñón crudo están aisladas de trasplante humano riñones de grado por perfusión de colagenasa. La suspensión resultante se cultiva hasta confluentes en los lysates de plaquetas de 5%. Entonces la fracción de células estromales perivasculares aislada basados en la expresión de NG2. kPSCs plástico adherente en forma de huso de las células (figura 2A) y son positivos para los marcadores estromales marcadores CD73, CD90, CD105 y perivascular NG2, PDGFR-B y CD146, mientras que la negativa para CD31 y CD34, CD45, HLA-DR (figura 2B). Por lo general, una población homogénea de kPSCs puede ser alcanzada en el paso 4 y kPSCs llegar a la Senectud en el paso 9 y 10 (figura 2C). Por lo tanto aconsejamos realizar experimentos entre el pasaje 5-8. Para evaluar la capacidad funcional de la kPSCs aisladas, realizamos un en vitro riñón epitelial de la herida rasguño ensayo en cada lote nuevo de kPSCs, como hemos demostrado anteriormente que el medio condicionado de kPSCs puede acelerar la cicatrización epitelial en este ensayo scratch15. El medio condicionado kPSC realiza cultivo kPSCs durante 48 h en alphaMEM 5% plaquetas lisados y recoger el sobrenadante. A continuación, el riñón humano inmortalizado proximal túbulo células epiteliales (HK-2)17 se cultivan hasta confluentes y entonces se hace una herida arañazo. Ya sea el medio condicionado de medio kPSCs o control se agrega a los pozos y se mide la velocidad de cicatrización de la herida. Cuando se agrega el medio condicionado de kPSCs, la herida cierra mucho más rápido (figura 2D). Figura 1 : KPSCs grado clínico de la método de aislamiento humano. Trasplante de riñones de grado son canulados y perfundidos con colagenasa vía la arteria renal (A – G) y la suspensión resultante se lava y ya sea congelados o poner en cultura (H – K). Después las células llegar a confluencia (L), NG2 enriquecimiento celular es realizar (M). Las células se tripsinizaron cuando cualquiera son confluente, han dejado de proliferar o cuando las estructuras 3D aparecen (N – P). Los criterios de liberación de kPSCs son la esterilidad, de expresión de marcador y la capacidad para mejorar la cicatrización de la herida epitelial tubular (Q). Flecha: arteria renal. Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: kPSCs caracterización de humanos. Un) kPSCs son células fusiformes, plástico adherentes. B) kPSCs son positivas para marcadores mesenquimales CD73, CD90, CD105, marcadores perivascular NG2, PDGFR-β y CD146, mientras que la negativa para CD31, CD34 y CD45. kPSCs expresar MHC clase I (HLA-ABC), pero no clase II (HLA-DR). C) características de crecimiento de tres donantes diferentes kPSC de citometría de flujo confirmaron homogénea NG2 positivo las poblaciones (paso 4). kPSCs llega a la senescencia en el paso 9 y 10. KPSCs D) son capaces de mejorar la reparación epitelial de riñón en un ensayo de rayado de herida. Imágenes representativas del medio de control y kPSC acondicionado medio en t = 0, 4, 8 y 12 h. Barra de escala en la A) = 200 μm, D) = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Células perivasculares se han aislado de muchas diferentes sólidos los órganos humanos, como páncreas, grasa, cartílago y el riñón^9,15,16. Mayoría de los métodos, sin embargo, se basa en pequeñas muestras de tejido, que son disecados y luego tratados con enzimas digestivas. Por otra parte, esto generalmente no se realiza con productos de grado clínico. Esto hace que estas estrategias menos conveniente para la traducción clínica directa donde son necesarias grandes cantidades de células de tipo clínico.

A continuación os mostramos un método de aislamiento novela de kPSCs humano de órganos enteros basados en perfusión con enzimas de grado clínico y materiales. El protocolo se adapta el protocolo de aislamiento clínico islotes de Langerhans actualmente en uso para su aplicación clínica en nuestro centro¹⁸.

Este es el primer grado clínico donde grandes cantidades de kPSCs pueden ser alcanzadas. La variabilidad en el rendimiento de la célula es en gran parte dependientes de donantes. Sin embargo, cuando el rendimiento celular que actualmente obtenemos de una fracción de la suspensión celular crudo de tres diferentes donantes se extrapola, en teoría, podría lograrse un rendimiento promedio de 2.7 x 10¹² kPSCs por donante. Como terapia MSC consiste en típicamente 2 infusiones de células con 1-2 x 10⁶ células/kg peso corporal⁴, estos números de celular son suficientes para alógeno tratamiento de varios pacientes.

Un paso crítico en el procedimiento de aislamiento es la duración de la digestión de la colagenasa. Cuando el período de digestión es demasiado corto, se mantendrá grumos grandes de tejido, que será más difícil a la cultura. Cuando el período de perfusión es demasiado largo, se puede observar la muerte creciente de la célula. Por lo tanto, tan pronto como el riñón empieza a ser suave y los fluidos menos transparentes, el riñón se debe masajear suavemente y debe suspenderse el tratamiento de la colagenasa.

Otro paso fundamental es el cultivo de las células después de enriquecimiento de células NG2. A veces tras el enriquecimiento de células NG2, las células perivasculares no empiece a proliferar o comienzan a crecer en las estructuras 3D. En este caso, cuando las células se tripsinizaron y resembraron, las células generalmente comenzará a crecer en cultivo monocapa.

Como material de partida, se utilizaron riñones de grado humano trasplante descartados por razones quirúrgicas. Estos son órganos funcionales sin fibrosis importante. Reconocemos que esto puede ser una limitación ya que este es un relativamente raro y difícil de obtener fuente de órganos. Los riñones explanted podrían ser otra fuente; sin embargo, dependiendo de la razón de la explantación de riñón, estos riñones pueden contener más fibrosis y miofibroblastos, y por lo tanto debe tenerse cuidado puesto que myofibroblasts podría aislado y cultivado en vez de células perivasculares.

El kPSCs aislado con este espectáculo de protocolo propiedades organo-typic con riñón epitelial habían herida curación capacidades¹⁵, terapia celular con kPSCs en enfermedades del riñón y trasplante sería una aplicación interesante en el futuro. Para ello, existen varias estrategias de entrega del producto celular de la célula. La primera estrategia es la infusión IV de kPSCs, como se utiliza actualmente en los estudios clínicos de bmMSC. Otra aplicación interesante es el uso de kPSCs o factores kPSC excreta en perfusión máquina antes del trasplante. De esta manera, podría mejorar la calidad del riñón explanted que podría conducir a función renal mejorada después del trasplante. Ambas estrategias de kPSCs son una fuente interesante de celular nuevo para explorar más a fondo para los propósitos clínicos.

Materials

Baxter bags	Fenwal	R4R-7004
Human platelets	Sanquin		hospital surplus material expired for less than 2 days is used
platelet lysate			custom made
Disposable sterile bottles	Corning	09-761-11
500ml PP centrifuge tubes	Corning	431123
a-MEM medium	Lonza	BE12-169F
glutamax	thermo fisher	35050038
pen/strep	Invitrogen	15070063
transfusion system	Codan	455609
DMEM-F12	life technologies	11320-074
normal human serum	Sanquin
Hepes 1M	Lonza	BE-17-737E
NaHCO3 7.5%	Lonza	BE17-613E
CaCl2 1M	Sigma-Aldrich	10043-52-4
UW	Bridge to life	32911
Heparin	Leo Pharma
collagenase NB1 GMP grade	SERVA	17455.03
DMSO	Sigma Aldrich	D2650-100ml
surgical drapes	3M Nederland	DH999969404
perfusion pump	metrohm	x007528300
pump head	metrohm	x077202600
perfusion tray			custom made
LS25 masterflex tubes	Masterflex	HV-96410-25
accessory spike	Gambro DASCO	6038020
pulmozyme	Roche
culture flasks 25 cm2	greiner	690175
culture flask 75 cm2	greiner	658170
culture flask 175 cm2	greiner	661160
Trypsin	sigma	t4174
BSA	Sigma	A2153
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500g
FcR blocking reagent	miltenyi	130-059-901
anti melanoma beads (NG2)	miltenyi	130-090-452
cellstrainer 70 µm	Corning	352350
LS columns	Miltenyi	130-042-401
MACS magnet	miltenyi	130-090-976
CD34 FITC	BD	555821
CD45 APC	BD	555485
CD146 PE	BD	550315
NG2 APC	R&D	FAB2585A
CD90 PE	BD	555596
HLA ABC APC	BD	555555
CD105 FITC	Ancell	326-040
HLA DR APC	BD	559866
CD56 PE	BD	555516
CD73 PE	BD	550257
CD31 FITC	BD	555445
CD133 PE	miltenyi	130-090-853
PDGF-r	R&D	mab 1263
mouse IgG1 FITC	BD	345815
mouse IgG1 PE	BD	345816
mouse IgG1 APC	BD	345818
IgG2b PE	BD	555743
goat anti mouse PE	Dako	R0480
sodium azide	Merck	822335
DMEM Ham’s F12	Gibco	31331-028
ITS (insul, transferrin, selenium)	Sigma	I1884
hydrocortisone	Sigma	H0135
triiodothyrinine	Sigma	T5516
epidermal growth factor	sigma	E9644
Immortalized human renal PTEC (HK2)			courtesey of M. Ryan, university college Dublin