Vedligeholdelse af blod-hjerne barriere dækning er nøglen til homeostasen i centralnervesystemet. Denne protokol beskriver in vitro teknikker til at afgrænse de grundlæggende og patologiske processer, der modulerer blod-hjerne barriere dækning.
Blood-brain barrier (BBB) dækning spiller en central rolle i homeostasen af centralnervesystemet (CNS). BBB holdes dynamisk af astrocytter, pericytter og hjerneendotelceller (BEC'er). Her beskriver vi metoder til vurdering af BBB-dækning ved anvendelse af enkeltkulturer af immortaliserede humane BEC'er, enkeltkulturer af primære mus-BEC'er og en humaniseret tripelkulturmodel (BEC, astrocytter og pericytter) af BBB. For at fremhæve anvendeligheden af analyserne til sygdomstilstande beskriver vi virkningen af oligomer amyloid-β (oAβ), hvilket er en vigtig bidragyder til Alzheimers sygdom (AD) progression på BBB-dækning. Derudover udnytter vi den epidermale vækstfaktor (EGF) for at belyse teknikkens lægemidlets screeningspotentiale. Vores resultater viser, at single og triple cultured BEC'er danner meshwork-lignende strukturer under basale forhold, og at oAβ forstyrrer denne celle meshwork formation og degenererer de præformede mesh strukturer,Men EGF blokerer for denne forstyrrelse. Således er de beskrevne teknikker vigtige for dissektering af grundlæggende og sygdomsrelevante processer, som modulerer BBB-dækning.
Blodhjernebarrieren (BBB) af cerebrale kapillærer er den største grænseflade af kontakt mellem blod og hjerne og spiller en central rolle i homeostasen i centralnervesystemet (CNS) 1 , 2 . Dynamiske processer på BBB forhindrer optagelse af uønskede molekyler fra blodet, fjerner affaldsprodukter fra CNS, leverer essentielle næringsstoffer og signalmolekyler til CNS og modulerer neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-skade er udbredt under aldring og flere neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom (AD), multipel sklerose og slagtilfælde 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Derfor kan BBB dysfunktion spille en central rolle i neurodegenerative lidelser, herunder som et terapeutisk mål.
Vedligeholdelse af skibsdækning er vigtigt for BBB's homeostatiske funktioner. Imidlertid er in vivo og in vitro datakonflikt om, hvorvidt processerne involveret i neurodegenerative lidelser forårsager højere eller lavere BBB-dækning 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , især i AD. Derfor er der en stærk begrundelse for udviklingen af in vitro- modeller ved brug af relevante celletyper til at vurdere og forståelsen af BBB-dækningsdynamikken dynamisk. Cerebral kapillærer er sammensat af astrocytter, pericytter og hjerne endotelceller (BEC) <sUp class = "xref"> 3. Alle celletyper bidrager til BBB's funktion gennem strukturel understøttelse og via sekretion af effektormolekyler, såsom angiogene vækstfaktorer, cytokiner og kemokiner, der virker i parakrin og autokrinlignende mode. De vigtigste effektorceller af BBB er imidlertid BEC 3 . Cellekultursteknikkerne til vurdering af BBB-funktion er generelt permeabilitetsassays udført på celler dyrket på filterindsatser eller vurdering af niveauer af centrale BEC-proteiner, begge efter tilsætning af stressorer 14 , 15 , 16 . Selv om det er vigtigt, fokuserer disse analyser ikke på cerebrovaskulær dækning.
Her er vores tidligere metoder 17 detaljerede for at vurdere BEC dækning og meshwork-lignende strukturer ved brug af enkeltkulturer af udødeliggjorte humane BEC'er, enkeltkulturer af primære mus-BEC'er og en humaniseret tredobbelt kulturModel (BEC, astrocytter og pericytter) af BBB. Målet var at demonstrere den skadelige virkning af oAβ, som betragtes som en vigtig bidragyder til AD-fremskridt på BEC-dækning. Den beskyttende virkning af den epidermale vækstfaktor (EGF) fremhæver potentialet ved teknikken som et terapeutisk screeningsværktøj. Teknikken har flere brede anvendelser til grundlæggende og anvendt forskning, herunder: 1) afgrænsning af rollen af specifikke veje angiogenese og dækningsdækning, 2) evaluering af virkningerne af sygdomme og aldringsrelevante faktorer ved angiogenese og dækningsdækning og 3) identificering af farmakologisk mål.
De beskrevne fremgangsmåder kan anvendes til at adressere flere grundlæggende biologiske spørgsmål omkring cerebrovaskulær dækning 24 . Specifikt kan de identificere hvilke receptorer og signalveje der spiller en rolle i angiogenese, fartøjsdækning i cancervæv og perifere endotelceller, der er relevante for hjernen. Eksempler indbefatter angiogene vækstfaktorreceptorer, nitrogenoxid, mitogenaktiveret proteinkinase-signalering og calciumsignalering 25 ,…
The authors have nothing to disclose.
Leon Tai er finansieret af University of Illinois Chicago startfonde.
hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |