في مقايسات المختبر لتقييم الحاجز الدموي الدماغي تشبه تشكيل سفينة وتشوه
Summary
الحفاظ على تغطية حاجز الدم في الدماغ هو المفتاح لتوازن الجهاز العصبي المركزي. يصف هذا البروتوكول في تقنيات المختبر لترسيم العمليات الأساسية والمرضية التي تعدل تغطية حاجز الدم في الدماغ.
Abstract
تلعب حاجز الدم في الدماغ (بب) دورا محوريا في توازن الجهاز العصبي المركزي (نس). يتم الحفاظ على حيوي بب بواسطة الخلايا النجمية، بيريسيتس والخلايا البطانية في الدماغ (بيكس). هنا، نحن بالتفصيل أساليب لتقييم تغطية بب باستخدام الثقافات واحدة من بيكس الإنسان الخالد، والثقافات واحدة من بيك الأساسي الماوس، ونموذج الثقافة الثلاثي أنسنة (بيكس، النجمية و بيريسيتس) من بب. لتسليط الضوء على تطبيق المقايسات لحالات المرض، ونحن تصف تأثير أميلويد أوليغوميريك β (oAβ)، الذي هو مساهم مهم في مرض الزهايمر (أد) التقدم، على تغطية بب. وعلاوة على ذلك، فإننا نستخدم عامل نمو البشرة (إغف) لإلقاء الضوء على إمكانية فحص المخدرات من التقنيات. نتائجنا تبين أن واحدة وثلاثية بيكس مثقف تشكل هياكل تشبه شبكة في ظل الظروف القاعدية، وأن oAβ يعطل هذه التشكيل خلية تشكيل ويتحول الهياكل شبكة بريفورمد،ولكن إغف يمنع هذا الاضطراب. وبالتالي، فإن التقنيات الموصوفة مهمة لتشريح العمليات الأساسية والمرض ذات الصلة التي تعدل تغطية بب.
Introduction
الحاجز الدموي الدماغي (بب) من الشعيرات الدموية الدماغية هو أكبر واجهة من الدم إلى الدماغ الاتصال ويلعب دورا رئيسيا في التوازن من الجهاز العصبي المركزي (نس) 1 ، 2 . العمليات الحيوية في بب منع امتصاص الجزيئات غير المرغوب فيها من الدم، وإزالة النفايات من الجهاز العصبي المركزي، وتوفير المواد الغذائية الأساسية وجزيئات الإشارة إلى الجهاز العصبي المركزي، وتعديل نيوروينفلاماشيون 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . تلف بب هو السائد خلال الشيخوخة والعديد من الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض الزهايمر (أد)، والتصلب المتعدد والسكتة الدماغية 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ،أس = "كريف"> 6. لذلك، قد تلعب خلل بب دورا رئيسيا في الاضطرابات العصبية، بما في ذلك كهدف علاجي.
الحفاظ على تغطية السفينة مهم لوظائف التماثل من بب. ومع ذلك، في الجسم الحي وفي المختبر تضارب البيانات على ما إذا كانت العمليات التي تنطوي على الاضطرابات العصبية تسبب أعلى أو أقل تغطية بب 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، وخاصة في م. لذلك، هناك مبرر قوي لتطوير نماذج في المختبر باستخدام أنواع الخلايا ذات الصلة لتقييم وفهم شامل لديناميات تغطية بب. وتتكون الشعيرات الدموية الدماغي من الخلايا النجمية، بيريسيتس والخلايا البطانية الدماغ (بيكس) <sأوب كلاس = "كريف"> 3. تساهم جميع أنواع الخلايا في وظيفة بب من خلال الدعم الهيكلي وعن طريق إفراز جزيئات المستجيب مثل عوامل نمو الأوعية الدموية، السيتوكينات والكيموكينات التي تعمل بطريقة باراكرين و أوتوكرين مثل. ومع ذلك، فإن الخلايا المستجيب الرئيسية لل بب هي بيكس 3 . بشكل عام، وتقنيات زراعة الخلايا لتقييم وظيفة بب هي مقايسات نفاذية أجريت على الخلايا التي تزرع على إدراج فلتر، أو تقييم مستويات البروتينات الرئيسية بيك، سواء بعد إضافة الضغوطات 14 ، 15 ، 16 . على الرغم من أهمية، هذه المقايسات لا تركز على التغطية الدماغية الوعائية.
هنا، يتم تفصيل أساليبنا السابقة 17 لتقييم تغطية بيك والهياكل الشبيهة بالشبكات باستخدام ثقافات واحدة من بيكس الإنسان الخالدة، والثقافات واحدة من بيك الأساسي الماوس، وثلاثة ثقافة إنسانيةنموذج (بيكس، أستروسيتس و بيريسيتس) من بب. وكان الهدف هو إظهار الأثر الضار لل OAβ، الذي يعتبر مساهما هاما في تقدم أد، على تغطية بيك. تأثير وقائي من عامل نمو البشرة (إغف) يسلط الضوء على إمكانات هذه التقنية كأداة الفحص العلاجي. هذه التقنية لديها العديد من التطبيقات واسعة للبحوث الأساسية والتطبيقية بما في ذلك: 1) تحديد دور مسارات محددة على الأوعية الدموية وتغطية السفينة، 2) تقييم آثار المرض والشيخوخة ذات الصلة العوامل على الأوعية الدموية وتغطية السفينة، و 3) تحديد الدوائية أهداف.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المذكورة يمكن استخدامها لمعالجة العديد من الأسئلة البيولوجية الأساسية المحيطة بالتغطية الدماغية الوعائية 24 . على وجه التحديد، فإنها يمكن أن تحدد أي المستقبلات ومسارات الإشارات تلعب دورا في الأوعية الدموية، وتغطية السفينة في أنسجة السرطان، و?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل ليون تاي من جامعة إلينوي شيكاغو بدء الأموال.
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
Referências
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer’s-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer’s disease, but not in Binswanger’s disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer’s disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer’s Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
