I Vitro Assays at vurdere blod-hjerne barriere mesh-lignende fartøj dannelse og afbrydelse
Summary
Vedligeholdelse af blod-hjerne barriere dækning er nøglen til homeostasen i centralnervesystemet. Denne protokol beskriver in vitro teknikker til at afgrænse de grundlæggende og patologiske processer, der modulerer blod-hjerne barriere dækning.
Abstract
Blood-brain barrier (BBB) dækning spiller en central rolle i homeostasen af centralnervesystemet (CNS). BBB holdes dynamisk af astrocytter, pericytter og hjerneendotelceller (BEC'er). Her beskriver vi metoder til vurdering af BBB-dækning ved anvendelse af enkeltkulturer af immortaliserede humane BEC'er, enkeltkulturer af primære mus-BEC'er og en humaniseret tripelkulturmodel (BEC, astrocytter og pericytter) af BBB. For at fremhæve anvendeligheden af analyserne til sygdomstilstande beskriver vi virkningen af oligomer amyloid-β (oAβ), hvilket er en vigtig bidragyder til Alzheimers sygdom (AD) progression på BBB-dækning. Derudover udnytter vi den epidermale vækstfaktor (EGF) for at belyse teknikkens lægemidlets screeningspotentiale. Vores resultater viser, at single og triple cultured BEC'er danner meshwork-lignende strukturer under basale forhold, og at oAβ forstyrrer denne celle meshwork formation og degenererer de præformede mesh strukturer,Men EGF blokerer for denne forstyrrelse. Således er de beskrevne teknikker vigtige for dissektering af grundlæggende og sygdomsrelevante processer, som modulerer BBB-dækning.
Introduction
Blodhjernebarrieren (BBB) af cerebrale kapillærer er den største grænseflade af kontakt mellem blod og hjerne og spiller en central rolle i homeostasen i centralnervesystemet (CNS) 1 , 2 . Dynamiske processer på BBB forhindrer optagelse af uønskede molekyler fra blodet, fjerner affaldsprodukter fra CNS, leverer essentielle næringsstoffer og signalmolekyler til CNS og modulerer neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-skade er udbredt under aldring og flere neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom (AD), multipel sklerose og slagtilfælde 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Derfor kan BBB dysfunktion spille en central rolle i neurodegenerative lidelser, herunder som et terapeutisk mål.
Vedligeholdelse af skibsdækning er vigtigt for BBB's homeostatiske funktioner. Imidlertid er in vivo og in vitro datakonflikt om, hvorvidt processerne involveret i neurodegenerative lidelser forårsager højere eller lavere BBB-dækning 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , især i AD. Derfor er der en stærk begrundelse for udviklingen af in vitro- modeller ved brug af relevante celletyper til at vurdere og forståelsen af BBB-dækningsdynamikken dynamisk. Cerebral kapillærer er sammensat af astrocytter, pericytter og hjerne endotelceller (BEC) <sUp class = "xref"> 3. Alle celletyper bidrager til BBB's funktion gennem strukturel understøttelse og via sekretion af effektormolekyler, såsom angiogene vækstfaktorer, cytokiner og kemokiner, der virker i parakrin og autokrinlignende mode. De vigtigste effektorceller af BBB er imidlertid BEC 3 . Cellekultursteknikkerne til vurdering af BBB-funktion er generelt permeabilitetsassays udført på celler dyrket på filterindsatser eller vurdering af niveauer af centrale BEC-proteiner, begge efter tilsætning af stressorer 14 , 15 , 16 . Selv om det er vigtigt, fokuserer disse analyser ikke på cerebrovaskulær dækning.
Her er vores tidligere metoder 17 detaljerede for at vurdere BEC dækning og meshwork-lignende strukturer ved brug af enkeltkulturer af udødeliggjorte humane BEC'er, enkeltkulturer af primære mus-BEC'er og en humaniseret tredobbelt kulturModel (BEC, astrocytter og pericytter) af BBB. Målet var at demonstrere den skadelige virkning af oAβ, som betragtes som en vigtig bidragyder til AD-fremskridt på BEC-dækning. Den beskyttende virkning af den epidermale vækstfaktor (EGF) fremhæver potentialet ved teknikken som et terapeutisk screeningsværktøj. Teknikken har flere brede anvendelser til grundlæggende og anvendt forskning, herunder: 1) afgrænsning af rollen af specifikke veje angiogenese og dækningsdækning, 2) evaluering af virkningerne af sygdomme og aldringsrelevante faktorer ved angiogenese og dækningsdækning og 3) identificering af farmakologisk mål.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beskrevne fremgangsmåder kan anvendes til at adressere flere grundlæggende biologiske spørgsmål omkring cerebrovaskulær dækning 24 . Specifikt kan de identificere hvilke receptorer og signalveje der spiller en rolle i angiogenese, fartøjsdækning i cancervæv og perifere endotelceller, der er relevante for hjernen. Eksempler indbefatter angiogene vækstfaktorreceptorer, nitrogenoxid, mitogenaktiveret proteinkinase-signalering og calciumsignalering 25 ,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Leon Tai er finansieret af University of Illinois Chicago startfonde.
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
Referências
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer’s-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer’s disease, but not in Binswanger’s disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer’s disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer’s Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
