Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.
Bloed-hersenbarrière (BBB) dekking speelt een centrale rol in de homeostase van het centrale zenuwstelsel (CNS). De BBB wordt dynamisch onderhouden door astrocyten, pericytes en hersenendotheelcellen (BEC's). Hier worden details beschreven om BBB-dekking te beoordelen met behulp van enkele culturen van onsterfelijke menselijke BEC's, enkele culturen van primaire muis-BEC's en een gehumaniseerd triple culture-model (BEC, astrocyten en pericyten) van de BBB. Om de toepasbaarheid van de analyses op ziektetoestanden te benadrukken beschrijven we het effect van oligomere amyloïde-ß (oAβ), die een belangrijke bijdrage levert aan de ziekte van Alzheimer (AD), op BBB-dekking. Verder gebruiken we de epidermale groeifactor (EGF) om het drugscreeningspotentieel van de technieken te verlichten. Uit onze resultaten blijkt dat enkelvoudige en drievoudige gecultiveerde BEC's meshwork-achtige structuren vormen onder basale omstandigheden en dat oAβ deze celwerkvorming vormt en de voorgevormde maasstructuren ontaardt,Maar EGF blokkeert deze verstoring. Zo zijn de beschreven technieken belangrijk voor het analyseren van fundamentele en ziekte-relevante processen die de BBB-dekking moduleren.
De bloed-hersenbarrière (BBB) van hersenschapsvaten is de grootste interface van bloed-tot-hersencontact en speelt een centrale rol in de homeostase van het centrale zenuwstelsel (CNS) 1 , 2 . Dynamische processen bij de BBB verhinderen de opname van ongewenste moleculen uit het bloed, verwijderen afvalstoffen uit het CNS, leveren essentiële voedingsstoffen en signaalmoleculen aan het CNS, en moduleren neuro-inflammatie 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-schade komt voor bij veroudering en verschillende neurodegeneratieve stoornissen waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), multiple sclerose en beroerte 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Daarom kan BBB-disfunctie een sleutelrol spelen bij neurodegeneratieve stoornissen, ook als therapeutisch doel.
Het behoud van de vaartuigdekking is belangrijk voor de homeostatische functies van de BBB. In vivo pt in vitro gegevensconflicten echter of de processen die bij neurodegeneratieve stoornissen betrokken zijn, een hoger of lager BBB-dekking veroorzaken 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , met name in AD. Daarom is er een sterke reden voor de ontwikkeling van in vitro modellen met behulp van relevante celtypen om de dynamiek van BBB-dekking te beoordelen en beter te begrijpen. Serebrale capillairen zijn samengesteld uit astrocyten, pericyten en hersenendotheelcellen (BEC's) <sUp class = "xref"> 3. Alle celtypes dragen bij tot de functie van de BBB door middel van structurele ondersteuning en via de afscheiding van effectormoleculen zoals angiogene groeifactoren, cytokinen en chemokines die op paracrine- en autocrine-achtige wijze optreden. De belangrijkste effectorcellen van de BBB zijn echter BEC's 3 . In het algemeen zijn de celcultuurtechnieken voor het beoordelen van BBB-functie permeabiliteitsbepalingen uitgevoerd op cellen die op filterinzetten worden gegroeid, of het beoordelen van niveaus van belangrijke BEC-eiwitten, beide na de toevoeging van stressors 14 , 15 , 16 . Hoewel belangrijk, concentreren deze analyses zich niet op de cerebrovasculaire dekking.
Hier zijn onze vorige methoden 17 gedetailleerd om BEC-dekking en meshwork-achtige structuren te beoordelen met behulp van enkele culturen van onsterfelijke menselijke BEC's, enkele culturen van primaire muis-BEC's en een gehumaniseerde triple cultuurModel (BEC, astrocyten en pericytes) van de BBB. Het doel was om het schadelijke effect van oAβ te demonstreren, die wordt beschouwd als een belangrijke bijdrage aan AD progressie, op BEC dekking. Het beschermende effect van de epidermale groeifactor (EGF) benadrukt het potentieel van de techniek als therapeutisch screeningsinstrument. De techniek heeft verschillende brede toepassingen voor basis- en toegepast onderzoek, waaronder: 1) het bepalen van de rol van specifieke pathways bij angiogenese en dekking van het vaatstelsel; 2) het evalueren van de effecten van ziekte- en verouderingsrelevante factoren op angiogenese en vaatbescherming; en 3) het identificeren van farmacologische targets.
De beschreven methoden kunnen worden gebruikt om verschillende fundamentele biologische vragen aan te pakken die betrekking hebben op cerebrovasculaire dekking 24 . Specifiek kunnen zij identificeren welke receptoren en signaalwegen een rol spelen bij angiogenese, vaatdekking in kankerweefsel en perifere endotheliale cellen die relevant zijn voor de hersenen. Voorbeelden omvatten angiogene groeifactorreceptoren, stikstofoxide, mitogeen geactiveerde proteïne kinase signalering en calcium signaler…
The authors have nothing to disclose.
Leon Tai wordt gefinancierd door University of Illinois Chicago start-up fondsen.
hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |