In-Vitro- Assays zur Beurteilung der Blut-Hirn-Schranke Mesh-artigen Gefäßbildung und -störung
Summary
Die Erhaltung der Blut-Hirn-Schranke Abdeckung ist der Schlüssel für die Homöostase des zentralen Nervensystems. Dieses Protokoll beschreibt in vitro- Techniken, um die fundamentalen und pathologischen Prozesse abzugrenzen, die die Blut-Hirn-Schrankenabdeckung modulieren.
Abstract
Blut-Hirn-Schranke (BBB) Abdeckung spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des zentralen Nervensystems (ZNS). Die BBB wird dynamisch durch Astrozyten, Perizyten und Hirn-Endothelzellen (BECs) gehalten. Hier stellen wir Methoden zur Beurteilung der BBB-Berichterstattung über einzelne Kulturen von verewalisierten menschlichen BECs, einzelne Kulturen von primären Maus-BECs und ein humanisiertes Triple-Kulturmodell (BECs, Astrozyten und Perizyten) der BBB vor. Um die Anwendbarkeit der Assays auf Krankheitszustände hervorzuheben, beschreiben wir die Wirkung von oligomeren Amyloid-β (oAβ), was ein wichtiger Faktor für die Alzheimer-Krankheit (AD) -Progression bei der BBB-Abdeckung ist. Weiterhin nutzen wir den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), um das Arzneimittel-Screening-Potential der Techniken zu beleuchten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass einzelne und dreifach kultivierte BECs unter basalen Bedingungen meshwork-ähnliche Strukturen bilden und dass oAβ diese Zell-Mesh-Formation stört und die vorgeformten Mesh-Strukturen degeneriert,Aber EGF blockiert diese Störung. So sind die beschriebenen Techniken für die Sezierung von fundamentalen und krankheitsrelevanten Prozessen wichtig, die die BBB-Abdeckung modulieren.
Introduction
Die Blut-Hirn-Schranke (BBB) von zerebralen Kapillaren ist die grösste Schnittstelle von Blut-zu-Gehirn-Kontakt und spielt eine zentrale Rolle in der Homöostase des Zentralnervensystems (ZNS) 1 , 2 . Die dynamischen Prozesse am BBB verhindern die Aufnahme von unerwünschten Molekülen aus dem Blut, entfernen Abfallprodukte aus dem ZNS, liefern dem NZS wesentliche Nährstoffe und Signalmoleküle und modulieren die Neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-Schäden sind während des Alterns vorherrschend und einige neurodegenerative Erkrankungen einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), Multiple Sklerose und Schlaganfall 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6 Daher kann die BBB-Dysfunktion eine Schlüsselrolle bei neurodegenerativen Erkrankungen spielen, auch als therapeutisches Ziel.
Die Erhaltung der Schiffsdeckung ist für die homöostatischen Funktionen der BBB wichtig. In vivo- und in vitro- Daten stehen jedoch Konflikte dar, ob die Prozesse, die bei neurodegenerativen Störungen auftreten, eine höhere oder niedrigere BBB-Abdeckung 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , insbesondere in AD, verursachen. Daher gibt es eine starke Begründung für die Entwicklung von In-vitro- Modellen mit relevanten Zelltypen zu bewerten und umfassender zu verstehen, die Dynamik der BBB-Abdeckung. Zerebrale Kapillaren bestehen aus Astrozyten, Perizyten und Hirn-Endothelzellen (BECs) <sUp class = "xref"> 3. Alle Zelltypen tragen zur Struktur der BBB durch strukturelle Unterstützung und über die Sekretion von Effektormolekülen wie angiogenen Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Chemokinen bei, die in parakrin- und autokrineartig wirken. Allerdings sind die großen Effektorzellen der BBB BECs 3 . Im Allgemeinen sind die Zellkulturtechniken zur Beurteilung der BBB-Funktion Permeabilitäts-Assays, die an Zellen durchgeführt werden, die auf Filtereinsätzen gezüchtet werden, oder die Bewertung von Niveaus von Schlüssel-BEC-Proteinen, sowohl nach der Zugabe von Stressoren 14 , 15 , 16 . Obwohl wichtig, diese Assays nicht auf die zerebrovaskuläre Abdeckung konzentrieren.
Hier sind unsere bisherigen Methoden 17 detailliert, um die BEC-Berichterstattung und die meshwork-artigen Strukturen unter Verwendung einzelner Kulturen von immortalisierten menschlichen BECs, einzelner Kulturen von primären Maus-BECs und einer humanisierten Tripelkultur zu bestimmenModell (BECs, Astrozyten und Perizyten) der BBB. Ziel war es, die nachteilige Wirkung von oAβ zu demonstrieren, die als wichtiger Beitrag zur AD-Progression auf der BEC-Berichterstattung gilt. Die schützende Wirkung des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) unterstreicht das Potenzial der Technik als therapeutisches Screening-Tool. Die Technik hat mehrere breite Anwendungen für die Grundlagenforschung und die angewandte Forschung, einschließlich: 1) Abgrenzung der Rolle spezifischer Wege auf Angiogenese und Gefäßabdeckung, 2) Bewertung der Auswirkungen von Krankheiten und Alterungsrelevanten Faktoren auf die Angiogenese und die Gefäßabdeckung und 3) die Identifizierung der pharmakologischen Zielen
Protocol
Representative Results
Discussion
Die beschriebenen Methoden können genutzt werden, um mehrere grundlegende biologische Fragen um die zerebrovaskuläre Abdeckung zu adressieren 24 . Insbesondere können sie identifizieren, welche Rezeptoren und Signalwege eine Rolle bei der Angiogenese, der Gefäßabdeckung im Krebsgewebe und den peripheren Endothelzellen spielen, die für das Gehirn relevant sind. Beispiele umfassen angiogene Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Stickstoffmonoxid, Mitogen-aktivierte Proteinkinase-Signalisierung und Calc…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Leon Tai wird von der University of Illinois Chicago Start-up-Fonds finanziert.
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
Referências
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer’s-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer’s disease, but not in Binswanger’s disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer’s disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer’s Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
