Opprettholdelse av blod-hjerne barriere dekning er nøkkelen til homeostasis av sentralnervesystemet. Denne protokollen beskriver in vitro teknikker for å avgrense de grunnleggende og patologiske prosessene som modulerer blod-hjerne barriere dekning.
Blod-hjernebarriere (BBB) dekning spiller en sentral rolle i homeostasen i sentralnervesystemet (CNS). BBB holdes dynamisk av astrocytter, pericytter og hjerne endotelceller (BEC). Her beskriver vi metoder for å vurdere BBB-dekning ved bruk av enkeltkulturer av immortaliserte humane BEC, enkeltkulturer av primære mus-BEC, og en humanisert triple-kulturmodell (BEC, astrocyter og pericytter) av BBB. For å markere anvendelighet av analysene til sykdomstilstander, beskriver vi effekten av oligomer amyloid-β (oAβ), som er en viktig bidragsyter til Alzheimers sykdom (AD) -progresjon, på BBB-dekning. Videre benytter vi den epidermale vekstfaktoren (EGF) for å belyse stoffets screeningspotensial av teknikkene. Våre resultater viser at single og triple cultured BECs danner meshwork-lignende strukturer under basale forhold, og at oAβ forstyrrer denne celle meshwork formasjonen og degenererer de preformed mesh strukturer,Men EGF blokkerer denne forstyrrelsen. Således er de beskrevne teknikkene viktige for å dissekere grunnleggende og sykdomsrelevante prosesser som modulerer BBB-dekning.
Blodhjernebarrieren (BBB) av cerebrale kapillærer er det største grensesnittet mellom blod-til-hjernekontakt og spiller en sentral rolle i hemostasen i sentralnervesystemet (CNS) 1 , 2 . Dynamiske prosesser på BBB forhindrer opptak av uønskede molekyler fra blodet, fjerner avfallsprodukter fra CNS, leverer essensielle næringsstoffer og signalmolekyler til CNS, og modulerer nevrologi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-skade er utbredt ved aldring og flere nevrodegenerative forstyrrelser, inkludert Alzheimers sykdom (AD), multippel sklerose og slag 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Derfor kan BBB-dysfunksjon spille en nøkkelrolle i neurodegenerative lidelser, inkludert som et terapeutisk mål.
Opprettholdelse av fartøyets dekning er viktig for de homeostatiske funksjonene til BBB. Imidlertid er in vivo og in vitro datakonflikt om hvorvidt prosessene involvert i nevrodegenerative forstyrrelser forårsaker høyere eller lavere BBB-dekning 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , spesielt i AD. Derfor er det en sterk begrunnelse for utviklingen av in vitro- modeller ved bruk av relevante celletyper for å vurdere og forståere dynamikken til BBB-dekning. Serebral kapillærer består av astrocytter, pericytter og hjerne endotelceller (BEC) <sOpp klasse = "xref"> 3. Alle celletyper bidrar til funksjonen til BBB gjennom strukturell støtte og via sekresjon av effektormolekyler som angiogene vekstfaktorer, cytokiner og kjemokiner som virker på parakrin- og autokrin-lignende måte. De viktigste effektorcellene til BBB er imidlertid BEC 3 . Generelt er cellekulturteknikkene for å vurdere BBB-funksjonen permeabilitetsanalyser utført på celler dyrket på filterinnlegg, eller vurdering av nivåer av sentrale BEC-proteiner, både etter tilsetning av stressorer 14 , 15 , 16 . Selv om det er viktig, fokuserer disse analysene ikke på cerebrovaskulær dekning.
Her er våre tidligere metoder 17 detaljert for å vurdere BEC-dekning og meshwork-lignende strukturer ved bruk av enkeltkulturer av immortaliserte humane BEC'er, enkeltkulturer av primære mus-BEC'er og en humanisert trippelkulturModell (BEC, astrocyter og pericytter) av BBB. Målet var å demonstrere den skadelige effekten av oAβ, som anses som en viktig bidragsyter til AD-progresjon, på BEC-dekning. Den beskyttende effekten av epidermal vekstfaktoren (EGF) fremhever potensialet av teknikken som et terapeutisk screeningsverktøy. Teknikken har flere brede anvendelser for grunnleggende og anvendt forskning, herunder: 1) avgrense rollen av spesifikke veier angiogenese og fartøy dekning, 2) evaluere effektene av sykdom og aldringsrelevante faktorer på angiogenese og fartøy dekning, og 3) identifisere farmakologiske mål.
De beskrevne fremgangsmåter kan benyttes for å adressere flere grunnleggende biologiske spørsmål rundt cerebrovaskulær dekning 24 . Spesifikt kan de identifisere hvilke reseptorer og signalveier som spiller en rolle i angiogenese, fartøyets dekning i kreftvev og perifere endotelceller som er relevante for hjernen. Eksempler inkluderer angiogene vekstfaktorreceptorer, nitrogenoksyd, mitogenaktivert proteinkinase-signalering og kalsiumsignalering 25 , <sup c…
The authors have nothing to disclose.
Leon Tai er finansiert av University of Illinois Chicago oppstartsfond.
hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |