Ensayos in vitro para evaluar la formación y la interrupción de los vasos sanguíneos de barrera hematoencefálica
Summary
El mantenimiento de la cobertura de la barrera hematoencefálica es clave para la homeostasis del sistema nervioso central. Este protocolo describe técnicas in vitro para delinear los procesos fundamentales y patológicos que modulan la cobertura de la barrera hematoencefálica.
Abstract
La cobertura de la barrera hematoencefálica (BBB) desempeña un papel central en la homeostasis del sistema nervioso central (SNC). El BBB es mantenido dinámicamente por astrocitos, pericitos y células endoteliales cerebrales (CEC). Aquí se detallan métodos para evaluar la cobertura de BBB usando cultivos únicos de BECs humanos inmortalizados, cultivos únicos de BECs de ratón primario y un modelo de cultivo triple humanizado (BECs, astrocitos y pericitos) de la BBB. Para resaltar la aplicabilidad de los ensayos a estados de enfermedad, describimos el efecto de la amiloide oligomérica-β (oAβ), que es un contribuyente importante a la progresión de la enfermedad de Alzheimer (AD), en la cobertura de BBB. Además, utilizamos el factor de crecimiento epidérmico (EGF) para iluminar el potencial de detección de fármacos de las técnicas. Nuestros resultados muestran que los BECs cultivados individuales y triples forman estructuras tipo malla bajo condiciones basales y que oAβ altera esta formación de malla celular y degenera las estructuras de malla preformadas,Pero EGF bloquea esta interrupción. Por lo tanto, las técnicas descritas son importantes para diseccionar procesos fundamentales y relacionados con la enfermedad que modulan la cobertura de BBB.
Introduction
La barrera hematoencefálica (BBB) de los capilares cerebrales es la mayor interfase de contacto entre sangre y desempeña un papel central en la homeostasis del sistema nervioso central (SNC) 1 , 2 . Los procesos dinámicos en el BBB evitan la absorción de moléculas no deseadas de la sangre, eliminan los productos residuales del SNC, suministran nutrientes esenciales y señalan moléculas al SNC, y modulan la neuroinflamación 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . El daño a la BBB es frecuente durante el envejecimiento y varios trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis múltiple y el accidente cerebrovascular 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Por lo tanto, la disfunción de la BBB puede desempeñar un papel clave en los trastornos neurodegenerativos, incluso como objetivo terapéutico.
Mantener la cobertura del buque es importante para las funciones homeostáticas de la BBB. Sin embargo, los datos de vivo e in vitro contradicen si los procesos implicados en trastornos neurodegenerativos causan una cobertura BBB más alta o más baja 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , particularmente en AD. Por lo tanto, existe una fuerte justificación para el desarrollo de modelos in vitro utilizando tipos de células relevantes para evaluar y comprender de manera más completa la dinámica de la cobertura BBB. Los capilares cerebrales están compuestos de astrocitos, pericitos y células endoteliales cerebrales (BEC) <sUp class = "xref"> 3. Todos los tipos de células contribuyen a la función de la BBB a través del soporte estructural ya través de la secreción de moléculas efectoras tales como factores de crecimiento angiogénicos, citoquinas y quimiocinas que actúan en forma parácrina y autocrina. Sin embargo, las principales células efectoras de la BBB son BECs 3 . En general, las técnicas de cultivo celular para evaluar la función de BBB son ensayos de permeabilidad realizados en células crecidas en insertos de filtro, o la evaluación de niveles de proteínas BEC claves, después de la adición de factores de estrés 14 , 15 , 16 . Aunque son importantes, estos ensayos no se centran en la cobertura cerebrovascular.
Aquí, nuestros métodos anteriores 17 se detallan para evaluar la cobertura de BEC y estructuras de malla-como utilizando culturas únicas de BEC humanos inmortalizados, cultivos únicos de BECs de ratón primario, y una triple cultura humanizadaModelo (BECs, astrocitos y pericitos) de la BBB. El objetivo era demostrar el efecto perjudicial de oAβ, que se considera un importante contribuyente a la progresión de AD, en la cobertura de BEC. El efecto protector del factor de crecimiento epidérmico (EGF) pone de relieve el potencial de la técnica como una herramienta de cribado terapéutico. La técnica tiene varias aplicaciones amplias para la investigación básica y aplicada, incluyendo: 1) delinear el papel de las vías específicas en la angiogénesis y la cobertura de los vasos, 2) evaluar los efectos de la enfermedad y los factores relacionados con el envejecimiento sobre la angiogénesis y la cobertura vascular; Objetivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos descritos pueden ser utilizados para abordar varias cuestiones biológicas fundamentales en torno a la cobertura cerebrovascular [ 24] . Específicamente, pueden identificar qué receptores y vías de señalización desempeñan un papel en la angiogénesis, la cobertura vascular en el tejido canceroso y las células endoteliales periféricas relevantes para el cerebro. Los ejemplos incluyen receptores del factor de crecimiento angiogénico, óxido nítrico, señalización de proteín…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
León Tai es financiado por la Universidad de Illinois Chicago fondos de puesta en marcha.
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
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