In vitro- analyser för att bedöma blod-hjärnbarriären Mesh-liknande fartygsformation och störning
Summary
Att upprätthålla blod-hjärnbarriär täckning är nyckeln till hemostasen i centrala nervsystemet. Detta protokoll beskriver in vitro- tekniker för att avgränsa de grundläggande och patologiska processerna som modulerar blod-hjärnbarriär täckning.
Abstract
Blood-brain barrier (BBB) täckning spelar en central roll i hemostas i centrala nervsystemet (CNS). BBB hålls dynamiskt av astrocyter, pericytes och hjärnendotelceller (BEC). Här beskriver vi metoder för att bedöma BBB-täckning med användning av enskilda kulturer av odödliga humana BEC, enskilda kulturer av primära mus-BEC och en humaniserad trippelkulturmodell (BEC, astrocyter och pericyt) hos BBB. För att lyfta fram användbarheten av analyserna till sjukdomstillstånd beskriver vi effekten av oligomer amyloid-P (oAβ), vilket är en viktig bidragsyter till Alzheimers sjukdom (AD) -framsteg, på BBB-täckning. Vidare använder vi den epidermala tillväxtfaktorn (EGF) för att belysa läkemedelsscreeningspotentialen hos teknikerna. Våra resultat visar att enkla och tredubblade odlade BEC bildar meshworkliknande strukturer under basala förhållanden och att oAβ stör denna cellnätverksbildning och degenererar de förformade maskestrukturerna,Men EGF blockerar denna störning. Således är de beskrivna teknikerna viktiga för att dissekera grundläggande och sjukdomsrelaterade processer som modulerar BBB-täckning.
Introduction
Blocket-hjärnbarriären (BBB) av cerebrala kapillärer är det största gränssnittet mellan blod och hjärnans kontakt och spelar en central roll i hemostasen i centrala nervsystemet (CNS) 1 , 2 . Dynamiska processer vid BBB hindrar upptag av oönskade molekyler från blodet, tar bort avfallsprodukter från CNS, levererar väsentliga näringsämnen och signalmolekyler till CNS och modulerar neuroinflammation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . BBB-skada är utbredd under åldrande och flera neurodegenerativa störningar inklusive Alzheimers sjukdom (AD), multipel skleros och stroke 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Röv = "xref"> 6. Därför kan BBB-dysfunktion spela en nyckelroll i neurodegenerativa störningar, inklusive som ett terapeutiskt mål.
Att behålla fartygets täckning är viktigt för BBB: s hemostatiska funktioner. In vivo och in vitro data konflikt om huruvida processerna som är involverade i neurodegenerativa störningar orsakar högre eller lägre BBB-täckning 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , särskilt i AD. Därför finns det en stark motivering för utvecklingen av in vitro- modeller med användning av relevanta celltyper för att bedöma och förstå djupare BBB-täckningens dynamik. Cerebral kapillärer är sammansatta av astrocyter, pericytes och hjärnendotelceller (BEC) <sUp class = "xref"> 3. Alla celltyper bidrar till BBB-funktionen genom strukturellt stöd och genom sekretion av effektormolekyler, såsom angiogena tillväxtfaktorer, cytokiner och kemokiner som verkar på parakrin-och autokrinliknande sätt. De viktigaste effektorcellerna hos BBB är emellertid BEC 3 . I allmänhet är cellodlingsteknikerna för att bedöma BBB-funktionen permeabilitetsanalyser utförda på celler odlade på filterinsatser, eller bedömning av nivåer av nyckel-BEC-proteiner, båda efter tillsats av stressorer 14 , 15 , 16 . Även om viktiga, fokuserar dessa analyser inte på cerebrovaskulär täckning.
Här är våra tidigare metoder 17 detaljerade för att bedöma BEC-täckning och meshworkliknande strukturer med användning av enskilda kulturer av odödliga humana BEC, enskilda kulturer av primära mus-BEC och en humaniserad trippel kulturModell (BEC, astrocyter och pericytes) av BBB. Målet var att demonstrera skadlig effekt av oAβ, som anses vara en viktig bidragsyter till AD-progression, på BEC-täckning. Den skyddande effekten av epidermal tillväxtfaktorn (EGF) framhäver potentialen hos tekniken som ett terapeutiskt screeningsverktyg. Tekniken har flera brett tillämpningar för grundläggande och tillämpad forskning, bland annat: 1) avgränsa rollen av specifika vägar för angiogenes och kärlskydd, 2) utvärdera effekterna av sjukdomar och åldringsrelevanta faktorer vid angiogenes och kärltäckning, och 3) identifiera farmakologiska mål.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beskrivna metoderna kan användas för att adressera flera grundläggande biologiska frågor kring cerebrovaskulär täckning 24 . Specifikt kan de identifiera vilka receptorer och signalvägar som spelar en roll vid angiogenes, kärltäckning i cancervävnad och perifera endotelceller som är relevanta för hjärnan. Exempel innefattar angiogena tillväxtfaktorreceptorer, kväveoxid, mitogenaktiverad proteinkinassignalering och kalciumsignalering 25 , <sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Leon Tai finansieras av University of Illinois Chicago startfonder.
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
Referências
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer’s disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer’s disease. PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer’s-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer’s disease, but not in Binswanger’s disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer’s disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer’s Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
