Kan-beyin bariyerinin korunması, merkezi sinir sisteminin homeostazı için kilit unsurdur. Bu protokol, kan-beyin bariyerinin kapsamını düzenleyen temel ve patolojik süreçleri tanımlamak için in vitro teknikleri tanımlamaktadır.
Kan-beyin bariyeri (BBB) kapsama merkezi sinir sisteminin (CNS) homeostazında merkezi bir rol oynamaktadır. BBB, astrositler, perisitler ve beyin endotel hücreleri (BEC'ler) tarafından dinamik olarak muhafaza edilir. Burada, ölümsüzleştirilmiş insan BEC'lerinin tek kültürleri, birincil fare BEC'lerin tek kültürleri ve BBB'nin bir hümanize üçlü kültür modeli (BEC'ler, astrositler ve perisitler) kullanarak BBB kapsama alanını değerlendirecek yöntemleri ayrıntılı olarak inceliyoruz. Tahlillerin hastalık durumlarına uygulanabilirliğini vurgulamak için, Alzheimer hastalığının (AD) ilerlemesine önemli katkıda bulunan oligomerik amiloid-β'nın (oAβ) BBB kapsamı üzerindeki etkisini tanımlıyoruz. Ayrıca, tekniklerdeki ilaç tarama potansiyelini aydınlatmak için epidermal büyüme faktörünü (EGF) kullanıyoruz. Sonuçlarımız, tek ve üçlü kültürlenmiş BEC'lerin temel koşullar altında ağ gibi yapılar oluşturduğunu ve oAβ'nın bu hücre ağ oluşumunu bozar ve önceden oluşturulmuş örgü yapılarını dejenere ettiğini,Ancak EGF bu aksama engeller. Bundan dolayı, tarif edilen teknikler, BBB kapsama alanını modüle eden temel ve hastalığa bağlı süreçleri ayırmada önemlidir.
Serebral kılcal damarların kan-beyin bariyeri (BBB), kan-beyin temasının en büyük arayüzüdür ve merkezi sinir sistemi (SSS) 1 , 2'nin homeostazında merkezi bir rol oynar. BBB'deki dinamik işlemler, istenmeyen moleküllerin kandan alınmasını önler, atık ürünleri MSS'den uzaklaştırır, gerekli besin maddelerini ve CNS'ye sinyal moleküllerini gönderir ve nöroinflamasyonu 1 , 2 , 3 , 4 , 5 modüle eder. Yaşlanma sırasında BBB hasarı ve Alzheimer hastalığı (AD), multipl skleroz ve inme 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ve 6'yı içeren çeşitli nörodejeneratif bozukluklar görülür.Ass = "xref"> 6. Bu nedenle, BBB disfonksiyonu terapötik bir hedef de dahil nörodejeneratif bozukluklarda önemli bir rol oynayabilir.
Gemi kapsama alanının korunması BBB'nin homeostatik işlevleri için önemlidir. Bununla birlikte, in vivo ve in vitro veriler, nörodejeneratif bozukluklardaki süreçlerin özellikle AD'de 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 yüksek veya düşük BBB kapsama alanına sahip olup olmadığı konusunda çatışma oluşturmaktadır. Bu nedenle, BBB kapsama alanının dinamiklerini daha kapsamlı olarak anlamak ve değerlendirmek için ilgili hücre tiplerini kullanan in vitro modellerin geliştirilmesi için güçlü bir gerekçe vardır. Beyin kılcal damarları, astrositler, perisitler ve beyin endotel hücrelerinden (BEC'ler) oluşur. <sUp class = "xref"> 3. Tüm hücre tipleri yapısal destek vasıtasıyla ve parakrin ve otokrin benzeri modda hareket eden anjiyojenik büyüme faktörleri, sitokinler ve kemokinler gibi efektör moleküllerin salgılanması yoluyla BBB'nin işlevine katkıda bulunur. Bununla birlikte, BBB'nin efektör hücreleri BEC'lerdir3. Genel olarak, BBB fonksiyonunu değerlendirmek için hücre kültürü teknikleri, hem stresörlerin 14 , 15 , 16 eklenmesinden sonra, filtre ekleri üzerinde büyütülen hücreler üzerinde gerçekleştirilen geçirgenlik testleri veya anahtar BEC proteinlerinin seviyelerini değerlendirmektir. Önemli olmasına rağmen, bu testler serebrovasküler kapsama odaklanmaz.
Burada önceki yöntemlerimiz, ölümsüzleştirilen insan BEC'lerinin tek kültürleri, birincil fare BEC'lerin tek kültürleri ve bir hümanize üçlü kültür kullanılarak BEC kapsamı ve ağ-yapı benzeri yapıları değerlendirmek için ayrıntılı olarak verilmektedirModel (BEC'ler, astrositler ve perisitler). Amaç, AD progresyonuna önemli katkıda bulunan oAβ'nın zararlı etkisini BEC kapsamı üzerine göstermekti. Epidermal büyüme faktörünün (EGF) koruyucu etkisi, tekniğin terapötik bir tarama aracı olarak potansiyelini vurgular. Teknik, temel ve uygulamalı araştırmalar için çeşitli geniş uygulamalara sahiptir: 1) anjiyogenez ve gemi kapsama alanındaki spesifik yolların rolünün belirlenmesi, 2) hastalık ve yaşlanmayla ilişkili faktörlerin anjiyogenez ve gemi kapsama alanındaki etkilerinin değerlendirilmesi ve 3) farmakolojik hedefler.
Tarif edilen yöntemler, serebrovasküler kapsama alanı ile ilgili çeşitli temel biyolojik soruları çözmek için kullanılabilir 24 . Spesifik olarak hangi reseptörlerin ve sinyal yollarının anjiyogenez, kanser dokusunda gemi kapsama alanı ve beynin ilgili olduğu periferik endotel hücrelerinde rol oynadığını tespit edebilirler. Örnekler, anjiyojenik büyüme faktörü reseptörleri, nitrik oksit, mitojen aktive protein kinaz sinyali ve kalsiyum sinyali 25 …
The authors have nothing to disclose.
Leon Tai Illinois Üniversitesi Chicago başlangıç fonlarıyla finanse edilir.
hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |