Drie-dimensionale weefsel ontworpen uitgelijnd Astrocyt netwerken vergemakkelijken zenuwstelsel regeneratie te recapituleren Developmental mechanismen

Summary

Wij demonstreren de ontwikkeling van zelf geassembleerde, driedimensionale bundels van lengterichting uitgelijnde astrocytic waarin en processen binnen het omhulsel van een roman biomaterial. Deze “levende steigers”, het tentoonstellen van micron-schaal diameter nog uitbreiding centimeter lengte, kan dienen als proefnetwerken neurologische mechanismen bestuderen of vergemakkelijken van neuroregeneration door leiding neuronale migratie en/of axonale ontworpen vastloper.

Abstract

Neurotrauma en neurodegeneratieve ziekte vaak leiden tot een blijvende neurologische tekorten als gevolg van de beperkte capaciteit van het centrale zenuwstelsel (CNS) ter vervanging van verloren neuronen en regenereren van axonale trajecten. Echter tijdens de ontwikkeling van het zenuwstelsel optreden neuronale migratie en axonale uitbreiding vaak langs trajecten gevormd door andere cellen, hierna aangeduid als “levende steigers”. Op zoek naar te emuleren deze mechanismen en voor het ontwerpen van een strategie die de remmende omgeving van het centraal zenuwstelsel omzeilt, dit manuscript presenteert een protocol om weefsel ontworpen Astrocyt gebaseerde “levende steigers”. We gebruikt wilt maken van deze constructies, een roman biomaterial omhulsel regeling voor het opwekken van astrocyten zelf monteren in dichte driedimensionale bundels van bipolaire lengterichting uitgelijnde waarin en processen. Eerste, holle hydrogel micro-kolommen werden geassembleerd, en de binnenste lumen was bedekt met collageen extracellulaire-matrix. Gedissocieerde cerebrale corticale astrocyten vervolgens werden geleverd in het lumen van de cilindrische micro-kolom en een kritische binnendiameter van < 350 µm, spontaan zelf uitgelijnd en uitbesteed aan het produceren van lange vezel-achtige kabels bestaande uit dichte bundels Astrocyt processen en collageen fibrillen meten 97% levensvatbaarheid van cellen en waren vrijwel uitsluitend samengesteld van astrocyten uiting geven aan een combinatie van de tussenliggende gloeidraad eiwitten gliale-fibrillary zuur eiwit (GFAP), vimentin, en nestin. Deze uitgelijnd Astrocyt netwerken werden gevonden om een tolerante substraat voor neuronale bevestiging en uitgelijnd neurite extensie. Bovendien houden deze constructies integriteit en uitlijning wanneer geëxtraheerd uit het omhulsel van de hydrogel, waardoor ze geschikt voor implantatie van de CNS. Deze voorgevormde constructies emuleren structureel belangrijkste cytoarchitectural elementen van natuurlijk voorkomende gliale gebaseerde “living steigers” in vivo. Als zodanig kunnen deze gemanipuleerde levende steigers dienen als proefnetwerken studeren neurologische mechanismen in vitro of vergemakkelijken van neuroregeneration door het regisseren van neuronale migratie en/of axonale vastloper na CNS degeneratie in vivo .

Introduction

Het centrale zenuwstelsel (CNS) heeft een beperkte capaciteit voor het tegengaan van het verlies en/of disfunctie van neuronen en axonale trajecten die gepaard gaan met aandoeningen zoals traumatisch hersenletsel (TBI), beroerte, ruggenmerg letsel (SCI) en neurodegeneratieve ziekte^{1 ,2,},^3,,^4,5. Neurogenese in het VNV is beperkt tot een beperkt aantal gebieden in de hersenen, belemmering voor het herstel van verloren neuronen^6,7. Bovendien, is regeneratie van verloren axonale trajecten in het VNV onvoldoende als gevolg van het ontbreken van gerichte begeleiding, de aanwezigheid van uitgroei remmers en reactieve astrogliosis na beschadiging zenuwweefsel^{2,8, 9,10}. Astrocyten hebben gewoonlijk diverse functies in het bijstaan van neuronen met ion homeostase, neurotransmitter klaring, synaps formatie en neurovasculaire koppeling¹¹. Niettemin, na zelfs milde beschadiging van zenuwweefsel, astrocyten kunnen moleculaire, structurele en functionele wijzigingen ondergaan als ze de overgang naar een hypertrofische staat¹¹. In reactie op de ernstige neurotrauma, deze veranderingen leiden tot de vorming van een litteken met een bijschaduw met migreren reactieve astrocyten en een laesie kern waarin leukocyten gelekt uit de gescheurde bloed – hersenbarrière (BBB), microglia, oligodendrocyten en fibroblasten^11,12,13. Deze reactieve astrocyten bereiken een morfologie van draadvormige, ongeorganiseerd processen en vertonen verhoogde expressie van tussenliggende gloeidraad eiwitten en chondroitin sulfaat-proteoglycans (CSPGs), die een belemmering vormen voor neurale regeneratie¹². Hoewel het gliale litteken aanvankelijk helpt BBB integriteit herstellen en voorkomen van transmissie van de ontstekingsreactie naar het omliggende gezonde weefsel, dient het als een fysische en biochemische barrière tegen axon regeneratie^{12,14 ,15,16}. Bijvoorbeeld, axonen die het gliale litteken optreden weergeven bolvormige Dystrofe groei kegels en onvolgroeide groei¹². Bovendien belemmert de desorganisatie van astrocytic processen na blessure de uitbreiding van het regenereren van axonen¹⁷. Het resultaat van deze remmende eigenschappen komt ook tot uiting in de vaak-permanente lichamelijke en neurologische waardeverminderingen op die patiënten na ernstige neurotrauma lijden, met inbegrip van TBI en SCI.

Ongeacht de extrinsieke uitdagingen functionele regeneratie in het VNV, zijn axonen aangetoond te beschikken over een intrinsieke vermogen om te regenereren. Bijvoorbeeld, suggereert de dynamische aard van de kegels Dystrofe groei in contact met het gliale litteken dat deze uitgangen behouden hun capaciteit uit te breiden van¹². Dus, het is van mening dat een belangrijke belemmering voor axonale uitgroei de remmende omgeving van de CNS na letsel en dat een meer tolerante omgeving is via vermindering van gliale littekens en/of verstrekken van regeneratieve bruggen over het litteken zou voordelige. Inderdaad, de vorige studies hebben aangetoond dat CNS neuronen aankonden axonen door middel van een laesie met behulp van perifere zenuwen transplantaten als bruggen, die een gunstiger omgeving voor axon regeneratie^{12,18, uit te breiden 19}. Verschillende andere strategieën zijn uitgeoefend om te exploiteren deze rudimentair regeneratief vermogen. Bijvoorbeeld, heeft manipulatie van cel groei signaalroutes in verschillende modellen van de schade geleid tot axonale regeneratie en gliale scar vermindering^10,20,21. Bovendien, hebben studies aangetoond dat behandeling met chondroitinase ABC, die de meerderheid van de suiker-ketens cleaves in CSPGs, de remmende werking van CSPGs uitgescheiden door reactieve astrocyten^{22 vermindert}. Ondanks de bemoedigende resultaten, deze benaderingen bieden geen regie begeleiding van groei kegels, die kan leiden tot afwijkende regeneratie¹², en ook geen rekening met het verlies aan neuronen. Cel-gebaseerde benaderingen hebben gebruikt in pogingen om te overwinnen van de gevolgen van de gliale litteken en om aan te vullen verloren cellen, met name neuronen. Sommige groepen hebben dedifferentiated reactieve astrocyten in neuronen, terwijl anderen hebben neurale voorlopercellen getransplanteerd in CNS laesies repopulate de schade-gebied en het bevorderen van axon regeneratie^{23,24, 25}. stamceltransplantatie alleen wordt echter beperkt door lage overlevingskansen, slechte integratie en het bescheiden vasthouden in de beschadigde weefsel⁵. Bovendien, deze cel-gebaseerde strategieën niet herstellen van interlokale axonale traktaten, vooral op een gecontroleerde manier. Daarom, biomaterialen in combinatie met andere benaderingen worden onderzocht als leverende voertuigen voor diverse neurale en voorlopercellen en groei factoren²⁶. Biomaterial-gebaseerde benaderingen zijn voorzien van een hoge mate van Ontwerpcontrole voor de productie van constructies die na te de specifieke fysieke, haptotaxic bootsen, en chemotaxic signalen aanwezig is in de driedimensionale (3D)-communicatie van de doel host weefsel^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproductie van deze Milieusignalen is primordiaal voor getransplanteerde cellen te presenteren native-achtige morfologie, proliferatie, migratie en signalering, onder andere neurobiologische kenmerken²⁹. Ondanks deze gunstige eigenschappen is vooruitgang dan traditionele cel geplaatste biomaterial steigers moeten tegelijkertijd bevorderen van gestuurde interlokale axonale regeneratie en vervanging van verloren neuronen.

“Levende steigers”, die te onderscheiden van andere cel-gebaseerde benaderingen als gevolg van de aanwezigheid van levende neurale cellen met een voorgevormde cytoarchitecture die native neuroanatomie emuleert een veelbelovende alternatieve aanpak is gebaseerd op zenuwweefsel ontworpen en/of Developmental mechanismen om gerichte vervanging, wederopbouw en herstel van de neurale circuits^4,35. Overwegingen bij het ontwerp van levende steigers zijn de fenotypes en de bronnen van neurale cellen, evenals de mechanische/fysische eigenschappen en de biochemische signalen gedicteerd door de samenstelling van de begeleidende biomaterialen³⁵. Na fabricage in vitro, deze levende steigers kunnen worden geïmplanteerd in vivo aan de huidige cel-celadhesie-moleculen en Chemotactische en neurotrophic signalen neurale cel migratie en axon uitgroei afhankelijk van de status actief worden gereguleerd en progressie van regeneratieve processen³⁵. Gliale cellen kunnen dienen als basis voor de gemanipuleerde cytoarchitecture van levende steigers, aangezien deze cellen verschillende ontwikkelings mechanismen in vivo bemiddelen. Tijdens de ontwikkeling van de hersenen rekenen nieuwe neuronen op basale processen met radiale glia verlengd van de ventriculaire zone naar de ontwikkelingslanden corticale plaat als levende steigers voor gestuurde migratie^36,37. Anderzijds uitbreiding van groei kegels zijn getoond om te oriënteren zich door het aftasten van de aantrekkelijke en afstotend signalen ontlokte door markering gliale cellen, en zogenaamde “baanbrekende” axonen worden voorgesteld om de juiste doelstellingen bereiken door uitbreiding langs vooraf gedessineerde gliale steigers^35,38,39. Gliale cellen zijn dus nodig voor de begeleiding van baanbrekende axonen, die later als axon gebaseerde dienen “levende steigers” om de projectie van “volger” axonen. Bovendien groei glia-gemedieerde mechanismen te volharden postnatale stadium manifesteren, zoals neuroblasten de rostraal migratoire stroom (RMS volgen) om te navigeren van de subventriculaire zone (SVZ), een van de weinige resterende gebieden van neurogenese in de volwassen hersenen, is aangetoond dat de bulbus olfactorius (OB)⁴⁰. Deze neuroblasten in de RMS migreren binnen de gliale buis (figuur 1A-1), die bestaat uit de lengterichting uitgelijnde astrocytic processen, via directe cel verklevingen en een gelokaliseerde oplosbare factoren^{37, 41}. ten slotte terwijl CNS schade in zoogdieren oorzaken verstoord astrocytic proces regeling vormen een gliale litteken dat fysiek axonale regeneratie^{17 belemmert}, veel bij niet-zoogdieren systemen ontbreken de vorming van een schadelijk gliale litteken. Daarentegen handhaven gliacellen bij niet-zoogdieren soorten meer georganiseerd, patronen die worden gebruikt als gidsen door de benadeelde regio^17,42,43uitgelijnd. Bijvoorbeeld, worden bij niet-zoogdieren SCI modellen, axonen getoond om te groeien in nauwe samenwerking met gliale bruggen oversteken van de laesie, suggereren een belangrijke rol voor georganiseerde gliale steigers als substraten axonale regeneratie en functionele herstel (te vergemakkelijken Figuur 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. recapitulatie van de neuroanatomische functies en de ontwikkelings/regeneratieve mechanismen zoals hierboven beschreven kan het opleveren van een nieuwe klasse van gemanipuleerde gliale gebaseerde levende steigers die gelijktijdig onvolwassen neuronale migratie kan rijden en axonale vastloper door anders niet-tolerante omgevingen, waardoor potentieel afzwakking van de gevolgen van neuronale en axon tract degeneratie geassocieerd met CNS letsel en ziekte.

Onze onderzoeksgroep heeft eerder ontworpen meerdere soorten levende steigers voor wederopbouw en herstel van axonale traktaten in het centraal zenuwstelsel en het perifere zenuwstelsel (PNS) via micro-weefsel ontworpen neurale netwerken (micro-TENNs) en weefsel gemanipuleerde zenuw transplantaties (TENGs), respectievelijk^27,46,47,48. Beide strategieën zijn inherent gebaseerd op het biomimicry. Micro-TENNs zijn anatomisch-geïnspireerde structuren ontworpen ter vervanging van structureel en functioneel axonale traktaten verbinden verschillende neuronale populaties van de hersenen. TENGs exploiteren de ontwikkelingstoxiciteit mechanisme van axon-vergemakkelijkt axonale regeneratie, wordt geïllustreerd door “volger” axon groei langs “pionier” axonen, om gerichte host axonale regeneratie^35,46,48. We onlangs gekapitaliseerd op de veelzijdigheid van de levende steiger techniek met behulp van een soortgelijke regeling omhulsel als micro-TENNs en op zoek naar inspiratie uit de glia gebaseerde mechanismen aanwezig in de gehele ontwikkeling. Hier, ontwikkelde we constructies bestaande uit uitgelijnde astrocytic bundels verspreid over de collagene lumen van een hydrogel micro-kolom⁴⁹. Deze astrocytic levende steigers zijn ontwikkeld door het eerste vullen een vergadering van de capillaire buis-acupunctuur-naald met vloeibare agarose als u wilt maken van een holle cilindrische hydrogel met een buitendiameter (OD) en de binnendiameter (ID) overeenkomt met de diameter van de buis en needle, respectievelijk. Na agarose gelering en extractie van de hydrogel micro-kolom van de capillaire buis, de holle interieur is bekleed met type I collageen leveren een omgeving tolerant voor Astrocyt hechting en uitgelijnd bundel vorming (figuur 1B -1). Daarna is de lumen bezaaid met cerebrale corticale astrocyten geïsoleerd van postnatale rat pups (figuur 1B-2). In tegenstelling tot tweedimensionale (2D) uitlijning technieken die afhankelijk zijn van de toepassing van elektrische velden, micropatterned groeven en extracellulaire matrix (ECM) eiwitten patronen, Astrocyt uitlijning in het levende schavot techniek is gebaseerd op zelf-assemblage volgens controleerbare variabelen zoals substraat kromming (kolom-ID), celdichtheid en collageen concentratie^50,51,52. De astrocyten contract remodelleren van de collageen en verwerven een bipolaire, overlangs uitgelijnde morfologie analoog aan de natuurlijke steigers waargenomen in vivo (figuur 1B-3). Inderdaad, we actief het gebruik van deze kabel-achtige structuren nastreven als fysieke substraten voor gerichte begeleiding van onrijpe neuronen migreren, alsmede het vergemakkelijken van axonale regeneratie via het ongunstige milieu van het beschadigde centraal zenuwstelsel, met name de zoogdieren gliale litteken (Figuur 1 c). Dit artikel zal presenteren de gedetailleerde fabricage methode voor de astrocytic micro-kolommen, fase contrast en immunofluorescentie beelden van de verwachte cytoarchitecture en een uitgebreide discussie over de huidige beperkingen en toekomstige richtingen van de techniek.

Figuur 1: inspiratie, Fabrication Protocol en voorgestelde toepassingen voor de uitgelijnde Astrocytic netwerken. (A) neurobiologische inspiratie: (1) neuroblasten die afkomstig zijn uit de neurogene subventriculaire zone (SVZ) gebruiken de lengterichting uitgelijnde gliale buis in de rostraal migratoire stroom (RMS) voor de geleide overgang naar de bulbus olfactorius (OB); (2) niet-zoogdieren zoals amfibieën en vis aankunnen regeneratie na zenuwweefsel beschadigen gedeeltelijk als gevolg van de vorming van een gliale brug verbindt de uiteinden van een laesie (bijvoorbeeld verbeelde ruggenmerg) en fungeert als een steiger voor de begeleiding van regenereren axonen. (B) fabricage overzicht: (1) de bouw van een micron-sized, holle hydrogel micro-kolom met de lumen bekleed met ECM, (2) zaaien van primaire corticale astrocyten geïsoleerd van postnatale rat pups, (3) zelf-assemblage van de lengterichting georiënteerde bundels in cultuur, en (4) extractie van de bundel van het omhulsel van de biomaterial voor toekomstige implantatie studies. (C) In vivo toepassingen: (1) deze levende steigers kunnen dienen als gemanipuleerde gliale buizen voor gestuurde neuron migratie van neurogene centra aan repopulate neuron-deficiënte regio’s; (2) de recapitulatie van de ontwikkelingstoxiciteit mechanisme van baanbrekende axon begeleiding en de regeneratieve mechanisme van gliale bruggen bij niet-zoogdieren kan deze astrocytic steigers met het vermogen om directe axon regeneratie over de niet-tolerante begiftigen omgeving van de zoogdieren gliale litteken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Protocol

Alle procedures werden goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik commissies bij de Universiteit van Pennsylvania en het Michael J. Crescenz veteranen zaken Medical Center en vastgehouden aan de richtlijnen zoals uiteengezet in de NIH Service volksgezondheidsbeleid op humaan Zorg en het gebruik van proefdieren (2015). 1. ontwikkeling van de Agarose Hydrogel Micro-kolommen Maak een agarose 3% gewicht/volume (w/v) oplossing door weging van 3 g van agarose en over te drag…

Representative Results

Aanvankelijk, fase contrast microscopie werd gebruikt om de progressie van Astrocyt hechting en bundel vorming en de algehele stabiliteit van de cytoarchitecture als functie van de tijd te controleren. 1 uur na de beplating bleken de astrocyten in het lumen van de micro-kolommen met een sferische morfologie (figuur 2A). 5 h, astrocyten begon uitbreiding van processen en contracten, terwijl door 8 h cellen tentoongesteld van een volledig proces-bevattende morf…

Discussion

In vergelijking met de meer ondersteunende omgeving voor de PNS, beperkt de CNS is met name bij de behandeling van de nadelige gevolgen van neurotrauma en neurodegeneratie. Na een ernstige belediging van de zoogdieren CNS, een gliale litteken gevormd, bestaande uit een kern van fibrotische en inflammatoire cellen omgeven door een dichte Zitschalen van ongeorganiseerd reactieve astrocyten die afscheiden van axon uitgroei-remmende proteoglycans¹⁴. Dit litteken fungeert als een fysische en biochemisc…

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).