Tredimensionella vävnadstekniska justerad Astrocyten nätverk att Recapitulate utvecklingsmässiga mekanismer och underlätta nervsystemet regenerering

Summary

Vi visa upp utvecklingen av själv monterade, tredimensionell buntar av längdriktningen justerad astrocytic somata och processer inom en roman biomaterial fodral. Dessa konstruerade ”levande ställningar”, uppvisar micron-skala diameter ännu att utvidga centimeter i längd, kan fungera som test-sängar att studera nervsystemets mekanismer eller underlätta neuroregeneration av rikta neuronala migration och/eller axonal pathfinding.

Abstract

Neurotrauma och neurodegenerativa sjukdomen ofta resultera i bestående neurologiska bortfall på grund av den begränsade kapaciteten på det centrala nervsystemet (CNS) att ersätta förlorade nervceller och regenerera axonal vägar. Dock under nervsystemet utveckling, neuronala migration och axonal förlängning ofta uppstå längs vägar som bildas av andra celler, kallad ”levande ställningar”. Detta manuskript strävar efter att efterlikna dessa mekanismer och utforma en strategi som kringgår den hämmande miljön i CNS, och presenterar ett protokoll för att fabricera vävnadstekniska Astrocyten-baserade ”levande ställningar”. För att skapa dessa konstruktioner, anställt vi en roman biomaterial fodral systemet att inducera astrocyterna att själv montera i tät tredimensionella buntar av bipolär longitudinellt-anpassade somata och processer. Första, ihåliga hydrogel mikro-kolumner var samlade, och inre lumen var belagda med kollagen-extracellulärmatrix. Dissocierade cerebral kortikal astrocyter levererades sedan in i lumen för cylindriska mikro-kolumnen och vid en kritisk inre diameter på < 350 µm, spontant själv arrangera i rak linje och kontrakterade att producera långa fiber-liknande kablar bestående av täta buntar Astrocyten processer och kollagen fibriller mäta 97% cellviabilitet och var nästan uteslutande består av astrocyter uttrycker en kombination av mellanliggande glödtråden proteiner glial fibrillary sura protein (Fredsgenomförande), vimentin, och nestin. Dessa linje Astrocyten nätverk hittades för att tillhandahålla ett tillåtande substrat för neuronal fastsättning och anpassad neurite förlängning. Dessutom upprätthålla dessa konstruktioner integritet och anpassning när den extraheras från den hydrogel fodral, vilket gör dem lämpliga för CNS implantation. Dessa förformade konstruktioner emulera strukturellt viktiga cytoarchitectural element av naturligt gliaceller-baserade ”living ställningar” in vivo. Som sådan, kan dessa konstruerade levande ställningar fungera som test-sängar att studera nervsystemets mekanismer i vitro eller underlätta neuroregeneration genom att rikta neuronala migration och/eller axonal pathfinding efter CNS degeneration i vivo .

Introduction

Det centrala nervsystemet (CNS) har begränsad förmåga att motverka den förlust eller dysfunktion av nervceller och axonal vägar som åtföljer villkor såsom traumatisk hjärnskada (TBI), stroke, ryggmärgen skadan (SCI) och neurodegenerativa sjukdomen^{1 ,2,3,4,5}. Neurogenes i CNS är begränsad till ett begränsat antal områden i hjärnan, hämmar återställandet av förlorade nervceller^6,7. Dessutom är regenerering av förlorade axonal vägar i CNS otillräcklig på grund av bristen på riktad vägledning, förekomsten av utväxt hämmare och reaktiva astrogliosis efter skada till nervvävnad^{2,8, 9,10}. Astrocyterna har vanligtvis olika funktioner hjälpa nervceller med ion homeostas, signalsubstansen clearance, synaps bildas och neurovaskulära koppling¹¹. Dock efter även lindriga skador till nervvävnad, kan astrocyter genomgå molekylär, strukturella och funktionella förändringar som de övergången till en hypertrofisk stat¹¹. Svar på svåra neurotrauma resultera ändringarna i bildandet av ett ärr med en penumbra innehållande migrerar reaktiva astrocyter och en lesion kärna som innehåller leukocyter som läckt ut från en brusten blod – hjärnbarriären (BBB), mikroglia, oligodendrocyter och fibroblaster^11,12,13. Dessa reaktiva astrocyter uppnå en morfologi av trådformiga, oorganiserad processer och uppvisar ökat uttryck av mellanliggande glödtråden proteiner och chondroitin sulfate proteoglykaner (CSPGs), som hindrar neurala regenerering¹². Även om gliaceller ärret hjälper först återställa BBB integritet och undvika överföring av den inflammatoriska reaktionen till omkringliggande frisk vävnad, fungerar det som en fysiska och biokemiska barriär mot axon regenerering^{12,14 ,15,16}. Exempelvis axoner som möter gliaceller ärret Visa uppsvällda dystrofa tillväxt kottar och hämmad tillväxt¹². Dessutom hindrar desorganisation av astrocytic processer efter skada utvidgning av regenererande axoner¹⁷. Resultatet av dessa hämmande egenskaper manifesteras i de ofta permanenta fysiska och neurologiska funktionsnedsättningar som patienter lider efter svår neurotrauma, inklusive TBI och SCI.

Oavsett de yttre utmaningarna funktionell förnyelse i CNS, har axoner visat sig ha en inneboende förmåga att regenerera. Exempelvis antyder den dynamiska karaktären av dystrofa tillväxt kottarna i kontakt med gliaceller ärret att dessa ändelser behåller sin kapacitet att utöka¹². Följaktligen, man tror att ett främsta hinder för axonal re-tillväxt är hämmande miljön efter skada CNS och som ger en mer tillåtande miljö via minska gliaceller ärrbildning och/eller tillhandahålla regenerativ broar över ärret skulle vara fördelaktiga. Ja, tidigare studier har visat att CNS nervceller kunde utvidga axoner genom en lesion med perifer nerv ympkvistar som broar, som medför en mer gynnsam miljö för axon regenerering^{12,18, 19}. Flera andra strategier har bedrivits för att utnyttja denna rudimentära förnyelseförmåga. Till exempel har manipulation av cell tillväxt signalvägar i olika skada modeller resulterat i axonal regenerering och gliaceller scar minskning^10,20,21. Studier har dessutom visat att behandling med chondroitinase ABC, som klyver majoriteten av sockerkedjor i CSPGs, minskar den hämmande effekten av CSPGs utsöndras av reaktiva astrocyter²². Trots de uppmuntrande resultat, dessa metoder ger inte riktat vägledningen av tillväxt kottar, vilket potentiellt kan resultera i aberrant regeneration¹², och också inte redovisa förlust av nervceller. Cellbaserade metoder har använts i försök att övervinna effekterna av gliaceller ärret och att återanskaffa förlorade celler, särskilt nervceller. Vissa grupper har dedifferentiated reaktiv astrocyter till nervceller, medan andra har transplanterats neurala stamceller in i CNS-lesioner att återbefolka området skada och främja axon regenerering^{23,24, 25}. stamcellstransplantation ensam är dock begränsad av låga överlevnaden, dålig integrering och blygsamma lagring i skadad vävnad⁵. Dessutom misslyckas dessa cellbaserade strategier att återställa långdistans axonal skrifter, särskilt på ett kontrollerat sätt. Därför biomaterial i kombination med andra metoder utforskas som leveransfordon för olika neurala och stamceller och tillväxt faktorer²⁶. Biomaterial-baserade metoder har en hög grad av kontroll att producera konstruktioner som efterliknar den specifika fysiska, haptotaxic och chemotaxic cues presentera i den tredimensionella (3D) närmiljön för target host vävnad^{27, 28,29,30,31,32,33,34}. Reproduktion av dessa Miljösignaler är avgörande för transplanterade celler presentera native morfologi, spridning, migration och signalering, bland andra neurobiologiska egenskaper²⁹. Trots dessa fördelaktiga egenskaper krävs avancemang bortom traditionella cell seedade biomaterial ställningar att samtidigt främja riktad långdistans axonal regenerering och ersätta förlorade nervceller.

En lovande alternativa tillvägagångssätt bygger på nervvävnad konstruerad ”levande ställningar”, som är åtskilda från andra cell-baserat tillvägagångssätt på grund av levande neurala celler med en förformade cytoarchitecture som emulerar infödda neuroanatomi och/eller utvecklingsmässiga mekanismer för att underlätta riktade utbyte, återuppbyggnad och regenerering av neurala kretsar^4,35. Överväganden för utformningen av levande ställningar inkluderar fenotyper och källor av neurala celler, samt mekanisk/fysiska egenskaperna och de biokemiska signalerna av sammansättningen av någon medföljande biomaterial³⁵. Efter tillverkning i vitro, dessa levande ställningar kan vara implanterad i vivo till nuvarande cell-adhesionsmolekyler och kemotaktisk och neurotrofa signalerar att aktivt reglera neurala cellmigration och axon utväxt beroende på tillståndet och progression av regenerativ processer³⁵. Gliaceller kan fungera som underlag för den bakåtkompilerade cytoarchitecture av levande ställningar eftersom dessa celler medla olika utvecklande mekanismer i vivo. Under hjärnans utveckling åberopa nya nervceller basala processer utvidgad genom radiella glia från ventrikulära zonen mot utveckla kortikala plattan som levande ställningar för riktad migration^36,37. Dessutom sträcker sig tillväxt kottar är visat att orientera sig genom att känna attraktivt och motbjudande signaler som framkallas av gliaceller VÄGSTOLPE celler, och så kallade ”banbrytande” axoner föreslås för att nå de rätta målen genom att utvidga längs pre mönstrade gliaceller ställningar^35,38,39. Gliaceller är således nödvändiga för vägledningen av banbrytande axoner, som senare tjäna som axon-baserade ”levande ställningar” direkt projektionen av ”efterföljare” axoner. Dessutom glia-medierad tillväxt mekanismer har visats kvarstå efter födseln, som neuroblasts följer rostralt flyttande strömmen (RMS) för att navigera från den subventrikulära zonen (SVZ), en av de få återstående områdena av neurogenes i den vuxna hjärnan, att den luktbulben (OB)⁴⁰. Dessa neuroblasts i RMS migrera inom gliaceller röret (figur 1A-1), som består av longitudinellt-anpassade astrocytic processer, via direkt cell-cell sammanväxningar och lokaliserade lösliga faktorer^{37, 41}. Slutligen, medan CNS skada i däggdjur orsakar stört astrocytic processen arrangemang bildar ett gliaceller ärr som fysiskt hindrar axonal regenerering¹⁷, många icke däggdjur system saknar bildandet av ett skadligt gliaceller ärr. Snarare, upprätthålla gliaceller icke däggdjur arter mer organiserad, justerad mönster som används som guider genom den skada regionen^17,42,43. Exempelvis i icke däggdjur SCI modeller visas axoner att växa i nära samarbete med gliaceller broarna över lesionen, vilket tyder på en viktig roll för organiserade gliaceller ställningar som substrat underlätta axonal regenerering och funktionell återhämtning ( Figur 1A -2) ^{42 , 44 , 45}. rekapitulation neuroanatomiska funktioner och de utvecklingsmässiga/regenerativa mekanismer som beskrivs ovan kan ge en ny klass av modifierade gliaceller-baserade levande ställningar som kan samtidigt driva omogna neuronala migration och axonal pathfinding genom annars icke-tillåtande miljöer, därmed potentiellt mildra effekterna av neuronala och axon tarmkanalen degeneration är associerad med CNS skada och sjukdom.

Vår forskargrupp har tidigare designat flera typer av levande ställningar för återuppbyggnad och regenerering av axonal skrifter i CNS och det perifera nervsystemet (PNS) via micro-vävnad konstruerade neurala nätverk (mikro-villkoren) och vävnad bakåtkompilerade nerv transplantat (TENGs), respektive^27,46,47,48. Båda strategierna baseras sig på biomimicry. Micro-villkoren är anatomiskt-inspirerade strukturer för att strukturellt och funktionellt ersätta axonal skrifter ansluta distinkta neuronala populationer av hjärnan. TENGs utnyttja utvecklingsmässiga mekanismen av axon-stödda axonal regenerering, exemplifierat av ”efterföljare” axon tillväxt längs ”pioneer” axoner, att uppnå riktade värd axonal regenerering^35,46,48. Vi nyligen balanserade på mångsidigheten hos levande schavotten tekniken använder ett liknande system för fodral som mikro-villkoren och söker inspiration från de glia-baserade mekanismerna presentera hela utveckling. Här utvecklade vi konstruktioner bestående justerad astrocytic buntar spanning kollagena lumen en hydrogel mikro-kolumn⁴⁹. Dessa astrocytic levande ställningar är utvecklat av första fylla en kapillär tube-akupunktur nål församling med flytande agarosgelelektrofores för att skapa en ihålig cylindrisk hydrogel med ytterdiameter (OD) och innerdiameter (ID) motsvarar diametrarna på de röret och nål, respektive. Efter agaros gelation och utvinning av hydrogel mikro-kolumnen från kapillärröret, ihåliga interiören är belagda med typ I kollagen att tillhandahålla en miljö som är tillåtande för Astrocyten vidhäftning och justerad bunt bildandet (figur 1B -1). Efteråt, lumen är seedade med cerebral kortikal astrocyter isolerade från postnatal råttungar (figur 1B-2). Tvärtemot tvådimensionell (2D) justering tekniker som förlitar sig på tillämpningen av elektriska fält, micropatterned grooves och extracellulär matrix (ECM) protein mönstring, astrocyt justering i levande schavotten bygger teknik på självmontering enligt kontrollerbara variabler såsom substrat krökning (kolumnen ID), cell densiteten och kollagen koncentration^50,51,52. Astrocyterna kontrakt och omskapa kollagen och förvärva en bipolär, longitudinellt-anpassade morfologi som är analoga med de naturliga ställningar som observerats i vivo (figur 1B-3). Faktiskt, vi bedriver aktivt användningen av dessa kabel-liknande strukturer som fysiska substrat för målinriktad vägledning av migrera omogna nervceller samt underlätta axonal regenerering genom den ogynnsamma miljön i skadade CNS, särskilt däggdjur gliaceller ärret (figur 1 c). Denna artikel kommer att presentera metoden detaljerade tillverkning för astrocytic mikro-kolumner, fas kontrast och immunofluorescens bilder av den förväntade cytoarchitecture och en omfattande diskussion om de nuvarande begränsningarna och framtida inriktningar av de teknik.

Figur 1: Inspiration, Fabrication protokoll och föreslagna program för de justerade Astrocytic nätverk. (A) neurobiologiska inspiration: (1) Neuroblasts med ursprung från neurogen subventrikulära zonen (SVZ) utnyttja längdriktningen justerad gliaceller röret i rostralt flyttande strömmen (RMS) för riktad övergång till luktbulben (OB); (2) icke-däggdjur såsom groddjur och fisk kan upprätthålla förnyelse efter nervvävnad skador delvis på grund av bildandet av en gliaceller bro som förbinder ändarna av en lesion (t.ex. transected ryggmärgen) och fungerar som en klätterställning för vägledningen av regenererande axoner. (B) tillverkning översikt: (1) byggandet av en micron stora, ihåliga hydrogel mikro-kolumn med lumen belagd med ECM, (2) sådd av primära kortikala astrocyter isolerade från postnatal råttungar, (3) självmontering av longitudinellt-orienterade buntar i kultur och (4) utvinning av bunten från den biomaterial fodral för framtida implantation studier. (C) In vivo program: (1) dessa levande ställningar kan tjäna som modifierade gliaceller rör för riktad neuron migrering från neurogen centra att återbefolka neuron-brist regioner. (2) rekapitulation av utvecklingstoxicitet mekanismen av banbrytande axon vägledning och regenerativ mekanismen av gliaceller broar i icke-däggdjur kan begåva dessa astrocytic ställningar med kapacitet att direkt axon regenerering över den icke-tillåtande miljön av däggdjur gliaceller ärr. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittéer på University of Pennsylvania och Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center och anslutit sig till de riktlinjer som anges i principen NIH Public Health Service på humant Skötsel och användning av försöksdjur (2015). 1. utveckling av agaros Hydrogel Micro-kolumner Göra en agaros 3% vikt/volym (w/v) lösning genom vägning 3 g av agaros och överföra den till en steril bägare i…

Representative Results

Inledningsvis, fas-kontrast mikroskopi användes för att övervaka utvecklingen av Astrocyten vidhäftning och bunt bildandet och den övergripande stabiliteten i cytoarchitecture som en funktion av tiden. På 1 h efter plätering hittades astrocyter i hela lumen micro-kolumner med en sfäriska morfologi (figur 2A). På 5 h, astrocyter började utvidga processer och upphandlande, medan av 8 h celler uppvisade en komplett process-bärande morfologi och bildad…

Discussion

Jämfört med mer stödjande miljö av PNS, är CNS särskilt begränsade i hantering av de skadliga följderna av neurotrauma och neurodegeneration. Efter en allvarlig förolämpning mot däggdjur CNS bildas ett gliaceller ärr, bestående av en kärna av fibrotiska och inflammatoriska celler omges av en tät meshwork av oorganiserad reaktiva astrocyter som utsöndrar axon utväxt-hämmande proteoglykaner¹⁴. Detta ärr fungerar som en fysiska och biokemiska obstruktion mot förnyelse av axon änd…

Materials

Acupuncture needle (300 µm diameter)	Lhasa Medical	HS.30×40	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column lumen.
Petri dish	Fisher	08772B
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polystyrene disposable serological pipet	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Microliter glass capillary tube (701 µm)	Fisher	21-170J	The diameter may be varied according to the desired size for the micro-column shell.
Microcap bulb dispenser	Fisher	21-170J	Bulb comes with the microcap tubes.
Hot plate	Fisher	SP88857200
Magnetic bar	Fisher	1451352
Micropipette	Sigma	Z683884-1EA
25 mm gauge needle	Fisher	14-826-49
Microscalpel	Roboz Surgical	RS-6270
Scissors	Fine Science Tools	14081-09
Forceps	World Precision Instruments	501985
Hot bead sterilizer	Sigma	Z378550-1EA
Stereoscope	Nikon	SMZ800N
Micro-spatula	Fisher	S50821
Rat tail type I collagen	Corning	354236	Maintain at 4 ºC and remove only when needed. Use ice to preserve its temperature when in use.
Microcentrifuge tube	Fisher	02-681-256
Sodium hydroxide (NaOH)	Fisher	SS2661
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher	SA48-1
Litmus paper	Fisher	09-876-18
Hank's balanced salt solution (HBSS)	Invitrogen	14170112	Store at 4 ºC.
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Bovine pancreatic deoxyribonuclease (Dnase) I	Sigma	10104159001	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with Ham's F-12 Nutrient Mixture	Gibco	11330-032	Store at 4 ºC.
Fetal bovine serum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11195	Store at -20ºC.
Postnatal day 0 or day 1 Sprague Dawley rat pups	Charles River	Strain 001
Neurobasal embryonic neuron basal medium	Invitrogen	21103049	Store at 4ºC and warm at 37 ºC before use.
B-27 serum free supplement	Invitrogen	12587010	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
L-glutamine	Invitrogen	35050061	Store at -20 ºC and warm at 37 ºC before use.
G5 astrocytic supplement	Invitrogen	17503012
Sprague Dawley embryonic day 18 rats	Charles River	Strain 001
Pasteur pipette	Fisher	22-042816
15 mL centrifuge tube	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Centrifuge	Fisher	05-413-115
Hemocytometer	Fisher	02-671-6
Incubator	Fisher	13 998 076
Formaldehyde 40%	Fisher	F77P-4	Formaldehyde is a toxic compound known to be carcinogenic, and must be disposed of in a separate container.
Glass cover slip	Fisher	12-548-5M
Nail polish	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72180
Fluoromont mounting medium	Southern Biotech	0100-01
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Phosphate buffered saline	Fisher	BP3994
Triton X-100	Sigma	T8787
Normal horse serum	Gibco	16050-122
Rabbit anti-glial acidic fibrillary protein (GFAP) primary antibody	Millipore	AB5804	Store at -20ºC.
Mouse anti-beta-tubulin III primary antibody	Sigma	T8578	Store at -20ºC.
Rabbit anti-collagen I primary antibody	Abcam	ab34710	Store at -20ºC.
Rabbit anti-vimentin	Millipore	AB3400	Store at -20ºC.
Mouse anti-nestin	Millipore	AB5326	Store at -20ºC.
Donkey anti-mouse 568 secondary antibody	Invitrogen	A10037	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 568 secondary antibody	Invitrogen	A10042	Store at 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 secondary antibody	Invitrogen	A21206	Store at 4ºC.
Hoechst 33342, Trihydrochloride	Invitrogen	H3570	Store at 4ºC. Hoechst is a known mutagen that should be treated as a carcinogen. Therefore, it must be disposed of in a separate container.
Calcein AM	Sigma	C1359	4 mM in anhydrous DMSO
Ethidium homodimer-1	Life Technologies	E1169	2 mM in DMSO/H2O 1:4 (v/v)
Dimethyl sulfoxane (DMSO)	Sigma	276855
A1RSI Laser Scanning Confocal Microscope	Nikon	————–	Used for taking the confocal reconstructions of immunolabeled constructs.
Eclipse Ti-S Microscope	Nikon	————–	Used for taking the phase-contrast images. With digital image acquisition using a QiClick camera interfaced with Nikon Elements Basic Research software (4.10.01).