En hurtig og effektiv metode til at dissekere puppe vinger af Drosophila velegnet til Immunodetections eller PCR Assays
Summary
Evnen til at præcist afsløre udskrifter eller proteiner i Drosophila væv er kritisk for at studere deres overflod og lokalisering relateret til udviklingsprocessen. Her er beskrivelsen af en ligetil procedure at dissekere puppe vinger. Disse vinger kan bruges som prøver i flere teknikker (immunhistokemi, PCR assay, osv.).
Abstract
Wing udvikling i Drosophila melanogaster er en ideel model for at studere morfogenese på væv plan. Disse vedhæng udvikle sig fra en gruppe af celler opkaldt wing fantasiens diske dannet under fosterudviklingen. Larve faser vokse af fantasiens diske, øge antallet af celler og danner monolayered epitelial strukturer. Inde i puppe sagen, de imaginære diske bud ud og fold i dobbeltlag langs en linje, der bliver den fremtidige margin af vingen. Under denne proces stammer de langsgående primodia vener vene celler på de potentielle dorsal og ventral overflader af vingen. Den puppe på stadiet kommunikere striber af vene celler af hver overflade for at generere stramme rør; på samme tid begynde cross-vener deres dannelse.
Ved hjælp af passende molekylære markører er det muligt at identificere de vigtigste elementer, komponere fløjen under dets udvikling. Af denne grund er evne til præcist afsløre udskrifter eller proteiner i denne struktur afgørende for at studere deres overflod og lokalisering relateret til udviklingsprocessen af vingen.
Proceduren beskrevet her fokuserer på manipulere puppe vinger, giver detaljerede instruktioner om hvordan man kan dissekere fløjen under den puppe stadie. Dissektion af puppe væv er mere vanskeligt at udføre end deres kolleger i tredje instar larver. Dette er grunden til, at denne tilgang blev udviklet, for at få hurtig og effektiv høj kvalitet prøver. Informationer til immunostain og mount disse fløj prøverne, tillade visualisering af proteiner eller celle komponenter, er fastsat i protokollen. Med lidt ekspertise er det muligt at indsamle 8-10 høj kvalitet puppe vinger i en kort tid.
Introduction
Drosophila vinger er udviklet fra wing fantasiens diske. Primordial af disse fløj diske er sat til side under fosterudviklingen som små grupper af 20-30 fantasiens celler, der invaginate fra embryonale epitel. Mens larver vokser til tredje instar fase, forekommer mitose i de imaginære celler på bestemte karakteristiske tidspunkter at hæve sine tal (ca 50000 celler) og danner fløjen disc1,2,3, 4. Da cellerne formere sig, mode de en rørformet epitel, hvilket resulterer i en selvstændig folde kompakte spiral. Under pupation, disc epitel teleskoper ud til form to-lags fløj og de langsgående vener starte som lakuner mellem dem, der forekommer to gange i løbet af wing udviklingsmæssige5,6.
Arrangement af årer altid har en identisk mønster; evne til nemt at identificere hver ændring i venerne dannelse gør mutationer meget synligt (f.eks. manglende eller ekstra årer, ændringer i vene holdninger osv.). Interessant, er fænotype variationer normalt beviser af mutationer i kendte eller nye komponenter af signalering veje, der er relevante for wing udvikling. En af de veje, der spiller en rolle i positioneringen og vedligeholde vene og intervein områder er pindsvin (Hh) vej6,7,8.
Betragtning af betydningen af den puppe fløj som en modelsystem, vil det være vigtigt at få god kvalitet prøver at arbejde med. I fortiden, har forskere, der har publiceret protokoller for at dissekere Drosophila vinger ikke givet en passende vejledning til at opnå brugbare prøver. Uden vejledning af en forsker visualisere ikke et klart processen. I disse alternative dissekere tilgange er puppe delt i to, adskille fløjen fra omkringliggende væv og gentagne gange vaskes for at fjerne snavs. Denne form for tilgang hævder at forlade den fløj gratis forurener, men på grund af tidligere erfaringer processen er langsommere, og der er en højere chance for at gå på kompromis struktur af skrøbelige vinger9.
Proceduren beskrevet her blev udviklet af kravet om at finde en hurtig og effektiv metode til at få puppe wing prøver egnet til at påvise bestemte proteiner eller udskrifter ved hjælp af immunodetection protokoller eller polymerase kædereaktion (PCR) assays. For at illustrere dette, udtryk og lokalisering af Patched (Ptc eller den kanoniske receptor af Hh pathway) er fundet i puppe wing prøver, giver en protokol, der indeholder relevante oplysninger til at gennemføre den komplette procedure.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden for dissektion beskrevet i denne video kan bruges til at forberede høj kvalitet prøver af Drosophila puppe vinger fra forskellige udviklingsfaser for mange typer af teknikker (fx immunofluorescens, cDNA syntese til PCR assays, in vitro- fløj udvikling). Med hensyn til denne metode har videnskabsmand involveret bruges 24-30 h APF. Dog bør der ingen hindring i de afgørende skridt i dissektion af yngre eller ældre puppe. Ændringer kan have til at rumme mindre fase puppe.
<p cla…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke CSIC for den finansielle støtte til dette projekt, at Mariana Di Doménico for hendes teknisk bistand med konfokalmikroskopi; til José Leonardo Báez for hans manuskript korrektioner; at Luciano Correa for hans dedikation til oprettelse af video; til Natalia Rosano for udlån hendes stemme til videoen og Bloomington Drosophila Stock Center for at give bestandene anvendes i denne undersøgelse. Apa1 monoklonalt anti-Ptc udviklet af Isabel Guerrero var indhentet fra udviklingsmæssige undersøgelser hybridom Bank (DSHB) under ledelse af NICHD og vedligeholdes af The University of Iowa, Biologisk Institut, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
Referências
- Serrano, N., O’Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
