إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى
Summary
يصف هذا البروتوكول انتعاش فيروس زيكا المعدية من استنساخ كدنا المعدية ثنائي البلازميد.
Abstract
استنساخ العدوى [كدنا] تسمح للتلاعب الجيني للفيروس، مما يسهل العمل على اللقاحات، المرضية، النسخ المتماثل، انتقال وتطور الفيروس. نحن هنا وصف بناء استنساخ المعدية لفيروس زيكا (زيكف)، الذي يسبب حاليا تفشي المتفجرات في الأمريكتين. لمنع السمية للبكتيريا التي لوحظت عادة مع البلازميدات المستمدة من فلافيروس، أنشأنا نظام البلازميد اثنين الذي يفصل الجينوم في الجين NS1 وأكثر استقرارا من البنيات كامل طول التي لا يمكن استردادها بنجاح دون الطفرات. بعد الهضم وربط للانضمام إلى شظيتين، يمكن أن تتولد كامل الحمض النووي الريبي الفيروسية طول عن طريق النسخ في المختبر مع T7 رنا البلمرة. بعد إليكتروبوراتيون من الحمض النووي الريبي كتب في الخلايا، تم استرداد الفيروس الذي عرضت مماثلة في حركية النمو المختبر وفي الجسم الحي الفوعة والأنماط الظاهرية العدوى في الفئران والبعوض، على التوالي.
Introduction
فيروس زيكا (زيكف؛ عائلة فلافيفريداي : جنس فلافيفيروس ) هو فيروس منقول بالبعوض الذي وصل إلى البرازيل في 2013-14، وكان مرتبطا بعد ذلك بفاشية واسعة من مرض الحمى التي انتشرت في جميع أنحاء الأمريكتين 1 . وبالإضافة إلى ذلك، تم ربط زيكف مع نتائج المرض الشديد، مثل متلازمة غيلان باريه في البالغين وصغر الرأس في الأجنة والحديثين 2 . ولم يعرف القليل عن زيكف قبل انتشاره السريع في نصف الكرة الغربي. وشمل ذلك نقص الأدوات الجزيئية، مما أعاق البحث الآلي. الأدوات الجزيئية للفيروسات، مثل الحيوانات المستنسخة كدنا المعدية، وتسهيل اللقاح والتنمية العلاجية المضادة للفيروسات، والسماح لتقييم العوامل الوراثية الفيروسية المتعلقة المرضية الفيروسية التفاضلية، والاستجابة المناعية والتطور الفيروسي.
ومن المعروف أن الحيوانات المستنسخة عدوى فيروس العوز المناعي البشري غير مستقرة للغاية في البكتيريا بسبب كريبتيك بروكاريوتيك المروجين موجودة في الجينومات الخاصة بهم 3 . وقد استخدمت عدة نهج لتحسين هذه المشكلة؛ بما في ذلك إدخال جنبا إلى جنب يكرر المنبع من تسلسل الفيروسية 4 ، طفرة من المفترضة متواليات بدائيات بدائية النواة 5 ، وتقسيم الجينوم إلى البلازميدات متعددة 6 ، ناقلات عدد النسخ المنخفضة (بما في ذلك الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية) 7 ، 8 وإدخال الإنترونات في الجينوم الفيروسي 9 . وقد وصفت نظام كامل طول دون تعديلات ل زيكف. ومع ذلك، يبدو أن هذا الاستنساخ الموهن في ثقافة الخلايا وفي الفئران 10 . وقد قامت مجموعات أخرى بتصنيع إنترونات في جينوم زيكف، مما يسمح بتعطيل تسلسل غير مستقر في البكتيريا التي يمكن أن تقسم في خلايا الثدييات في المختبر لإنتاج الفيروس المعدية 11، 12 . بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام نظام القائم على ير بعنوان العدوى سوبجينوميك-أمبليكونس بنجاح لإنقاذ سلالة MR766 النموذج من زيكف 13 . إن المنهج الموصوف هنا لا يتطلب أي تسلسل أجنبي، بل يعطل الجينوم في المنطقة من عدم الاستقرار العالي باستخدام البلازميدات المتعددة، والتي سبق استخدامها بنجاح مع الحمى الصفراء 6 ، حمى الضنك 14 ، 15 وفيروسات غرب النيل 16 . وعلاوة على ذلك، إضافة تسلسل ريبوزيمي التهاب الكبد D في تيرميني الجينومي الفيروسي يسهل إنشاء نهاية أصيلة 3 'دون الحاجة إلى إضافة موقع الخطي. بالإضافة إلى ذلك، يتم بناء كلا البلازميدات في ناقلات عدد منخفض نسخة (pACYC177، ~ 15 نسخة لكل خلية) للتخفيف من أي سمية المتبقية 17 . فيروس تعافى يعرض لمحة النمو مماثلة لفيروس الوالدية في منحنيات نمو المختبر في 8 خطوط الخلايا التي تضم مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المستمدة من كل من الثدييات والحشرات، وعرضت ملامح مماثلة المسببة للأمراض في الفئران والعدوى، ونشر ونقل معدلات في البعوض 18 .
هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول يصف كيفية زراعة البلازميدات استنساخ المعدية، وتوليد كامل طول الحمض النووي الريبي الفيروسي (الجينوم الفيروسي) في المختبر، واستعادة الفيروس المعدية في ثقافة الخلية. أولا، نحن تصف انتشار البلازميدات في البكتيريا أو خالية من البكتيريا التضخيم باستخدام المتداول دائرة التضخيم (رسيا). بعد ذلك، وتبين لنا كيف يتم هضم البلازميدات اثنين ومن ثم ليغاتد لاحقا معا لتوليد كامل طول الفيروس. وأخيرا، نحن تصف إنتاج الحمض النووي الريبي المنقولة وما يليه إليكتروبوراتيون في خلايا فيرو، تليها المعايرة من فيروس تعافى ( الشكل 1 ). النهج الموصوف هو سريع، مما يسمح فوr استعادة مخزونات الفيروسات المعدية في 1-2 أسابيع.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we describe a method for the recovery of a bipartite infectious cDNA clone system for ZIKV. Previously described clones for ZIKV suffer from either attenuation or require the addition of introns, making plasmids larger and preventing rescue in insect cells. Infectious virus can be recovered using the two-plasmid clone system in either mammalian or insect cells (data not shown). In addition, virus recovered from this system behaves similarly to wild-type virus in several cell lines, in an immunocompromised mouse mode…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا كريستين بولارد-فيبلمان وميلينا فيسيلينوفيتش وكلوديا روكيرت على مساعدتهم في وصف الفيروس المستخرج من النسخ المستنسخ. وأيد هذا العمل جزئيا من المنح المقدمة من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية، المعاهد الوطنية للصحة في إطار المنح AI114675 (بجج) و AI067380 (جدي).
Materials
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carbenicillin, Disodium Salt | various | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit | Zymo Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20,000 units/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20,000 units/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10,000 units/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20,000 units/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20,000 units/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20,000 units/ml |
| illustra TempliPhi 100 Amplification Kit | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1,000 units/ml |
| Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10,000 units/ml |
| T4 DNA Ligase | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA mRNA Kit | New England BioLabs | E2065S | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 High Throughput Electroporation System | BTX | 45-0423 | Other machines are acceptable. |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma | L3147 | Can be homemade as well. |
| Terrific Broth | Sigma | T0918 | Can be homemade as well. |
| Petri Dish | Celltreat | 229693 | |
| Culture Tubes | VWR International | 60818-576 | |
| T75 flasks | Celltreat | 229340 | |
| T182 flasks | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM with L-glutamine and 4.5 g/L glucose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanth Powder | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Ethanol Denatured | VWR International | BDH1156-1LP | |
| 6 well plate | Celltreat | 229106 | |
| 12 well plate | Celltreat | 229111 | |
| Sequencing Oligos | IDT | see table 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | other methods are acceptable. |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher | Q32850 | other methods are acceptable. |
| Qubit RNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32852 | other methods are acceptable. |
| Class II Biosafety Cabinet | Varies | N/A | This is necessary for live-virus work. |
Referências
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill. 19 (9), (2014).
- Li, D., Aaskov, J., Lott, W. B. Identification of a cryptic prokaryotic promoter within the cDNA encoding the 5′ end of dengue virus RNA genome. PLoS One. 6 (3), e18197 (2011).
- Pu, S. Y., et al. A novel approach to propagate flavivirus infectious cDNA clones in bacteria by introducing tandem repeat sequences upstream of virus genome. J Gen Virol. 95 (Pt 7), 1493-1503 (2014).
- Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
- Rice, C. M., Grakoui, A., Galler, R., Chambers, T. J. Transcription of infectious yellow fever RNA from full-length cDNA templates produced by in vitro ligation. New Biol. 1 (3), 285-296 (1989).
- Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
- Gualano, R. C., Pryor, M. J., Cauchi, M. R., Wright, P. J., Davidson, A. D. Identification of a major determinant of mouse neurovirulence of dengue virus type 2 using stably cloned genomic-length cDNA. J Gen Virol. 79 (Pt 3), 437-446 (1998).
- Johansen, I. E. Intron insertion facilitates amplification of cloned virus cDNA in Escherichia coli while biological activity is reestablished after transcription in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (22), 12400-12405 (1996).
- Shan, C., et al. An Infectious cDNA Clone of Zika Virus to Study Viral Virulence, Mosquito Transmission, and Antiviral Inhibitors. Cell Host Microbe. 19 (6), 891-900 (2016).
- Schwarz, M. C., et al. Rescue of the 1947 Zika Virus Prototype Strain with a Cytomegalovirus Promoter-Driven cDNA Clone. mSphere. 1 (5), (2016).
- Tsetsarkin, K. A., et al. A Full-Length Infectious cDNA Clone of Zika Virus from the 2015 Epidemic in Brazil as a Genetic Platform for Studies of Virus-Host Interactions and Vaccine Development. MBio. 7 (4), (2016).
- Gadea, G., et al. A robust method for the rapid generation of recombinant Zika virus expressing the GFP reporter gene. Virology. 497, 157-162 (2016).
- Kapoor, M., Zhang, L., Mohan, P. M., Padmanabhan, R. Synthesis and characterization of an infectious dengue virus type-2 RNA genome (New Guinea C strain). Gene. 162 (2), 175-180 (1995).
- Messer, W. B., et al. Development and characterization of a reverse genetic system for studying dengue virus serotype 3 strain variation and neutralization. PLoS Negl Trop Dis. 6 (2), e1486 (2012).
- Kinney, R. M., et al. Avian virulence and thermostable replication of the North American strain of West Nile virus. J Gen Virol. 87 (Pt 12), 3611-3622 (2006).
- Chang, A. C., Cohen, S. N. Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J Bacteriol. 134 (3), 1141-1156 (1978).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. 91 (1), (2017).
- Roberts, P. L., Lloyd, D. Virus inactivation by protein denaturants used in affinity chromatography. Biologicals. 35 (4), 343-347 (2007).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. J Vis Exp. (93), e52065 (2014).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Development and Characterization of Recombinant Virus Generated from a New World Zika Virus Infectious Clone. J Virol. , (2016).
- Grubaugh, N. D., et al. Genetic Drift during Systemic Arbovirus Infection of Mosquito Vectors Leads to Decreased Relative Fitness during Host Switching. Cell Host Microbe. 19 (4), 481-492 (2016).
