Este protocolo descreve a recuperação do vírus Zika infeccioso a partir de um clone de cDNA infeccioso com dois plasmídeos.
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Artigo de método
Salvamento e Caracterização do Vírus Recombinante de um Clone Infeccioso do Vírus do Novo Mundo Zika
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os clones de cDNA infecciosos permitem a manipulação genética de um vírus, facilitando assim o trabalho em vacinas, patogênese, replicação, transmissão e evolução viral. Aqui descrevemos a construção de um clone infeccioso para o vírus Zika (ZIKV), que atualmente está causando um surto explosivo nas Américas. Para evitar a toxicidade para bactérias comumente observadas com plasmídeos derivados de flavivírus, geramos um sistema de dois plasmídeos que separa o genoma no gene NS1 e é mais estável que as construções de comprimento total que não puderam ser recuperadas com sucesso sem mutações. Após a digestão e a ligação para unir os dois fragmentos, o ARN viral completo pode ser gerado por transcrição in vitro com polimerase de ARN T7. Após a eletroporação do ARN transcrito nas células, recuperou-se o vírus que apresentava cinética de crescimento in vitro semelhante e fenótipos de virulência e infecção in vivo em camundongos e mosquitos, respectivamente.
Introdução
O vírus Zika (ZIKV; Família Flaviviridae : Gênero Flavivírus ) é um flavivírus transmitido por mosquito que chegou ao Brasil em 2013-14 e posteriormente foi associado a um surto maciço de doença febril que se espalhou pelas Américas 1 . Além disso, o ZIKV tem sido associado a desfechos graves da doença, como a síndrome de Guillain-Barré em adultos e microcefalia em fetos e neonatos 2 . Pouco se sabia sobre ZIKV antes da sua rápida propagação no hemisfério ocidental. Isso incluiu a falta de ferramentas moleculares, dificultando assim a pesquisa mecanicista. Ferramentas moleculares para vírus, t....
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Protocolo
1. Transformação e Recuperação de Plasmídeos de Clone Infecciosos
- Transforme ambos os plasmídeos (separadamente) usando um protocolo de transformação comercial ( por exemplo , NEB 5 Minute Transformation Protocol) com algumas modificações. Ambos os plasmídeos contêm um gene que codifica a resistência à ampicilina, portanto, use ampicilina ou carbenicilina para seleção. A carbanilhilina é preferida, pois é mais estável.
- Remova as células (veja a Tabela de Materiais) a partir de um congelador de -80 ° C e descongelar no gelo durante 5-10 min. Caldo de lisogenia de pré-aquecimento (LB) (contendo placas de 10 g / L de NaCl e ....
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Resultados
O protocolo aqui descrito permite a recuperação do vírus Zika infeccioso derivado de clones. Manipular o sistema de clones infecciosos de dois plasmídeos é direto quando realizado com cuidado, em comparação com versões completas que são altamente instáveis (dados não mostrados). Após a digestão e a ligação das duas peças distintas, o ARN tampado é produzido usando transcrição in vitro com polimerase T7 que é então eletroporada em células Vero ( Figura 1
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Discussão
Aqui descrevemos um método para a recuperação de um sistema de clone de cDNA infeccioso bipartido para ZIKV. Os clones para ZIKV descritos anteriormente sofrem atenuação ou requerem a adição de íntrons, tornando os plasmídeos maiores e impedindo o resgate em células de insetos. O vírus infeccioso pode ser recuperado usando o sistema de clones de dois plasmídeos em células de mamíferos ou insetos (dados não mostrados). Além disso, o vírus recuperado desse sistema se comporta de forma semelhante ao vírus do tipo selvagem e.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Kristen Bullard-Feibelman, Milena Veselinovic e Claudia Rückert por sua assistência na caracterização do vírus derivado de clones. Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas, NIH sob subsídios AI114675 (BJG) e AI067380 (GDE).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| NEB Stable CompetentE. coli | New England BioLabs | C3040H | |
| Carpenicilina, Sal Dissódico | vários | ||
| Zyppy Plasmid Miniprep Kit Zymo | Research | D4036 | |
| ZymoPURE Plasmid Maxiprep Kit | Zymo Research | D4202 | |
| SalI-HF | New England BioLabs | R3138S | 20.000 unidades/ml |
| NheI-HF | New England BioLabs | R3131S | 20.000 unidades/ml |
| ApaLI | New England BioLabs | R0507S | 10.000 unidades/ml |
| EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | 20.000 unidades/ml |
| BamHI-HF | New England BioLabs | R3136S | 20.000 unidades/ml |
| HindIII-HF | New England BioLabs | R3104S | 20.000 unidades/ml |
| illustra TempliPhi 100 Kit de Amplificação | GE Healthcare Life Sciences | 25640010 | |
| NucleoSpin Gel e PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.5 | |
| Fosfatase Alcalina de Camarão (rSAP) | New England BioLabs | M0371S | 1.000 unidades/ml |
| Fosfatase Alcalina, Intestino de Bezerro (CIP) | New England BioLabs | M0290S | 10.000 unidades/ml |
| T4 DNA Kit de | New England BioLabs | M0202S | 400,000units/mL |
| HiScribe T7 ARCA | New England BioLabs | E2065S | |
| Células Vero | ATCC | CCL-81 | |
| ECM 630 Sistema de Eletroporação de Alto Rendimento | BTX | 45-0423 | Outras máquinas são aceitáveis. |
| Caldo LB com ágar (Miller) | Sigma | L3147 | Também pode ser caseiro. |
| Ótimo Caldo | Sigma | T0918 | Pode ser caseiro também. |
| Placa de Petri | Celltreat | 229693 | |
| Tubos de cultura | VWR International | 60818-576 | |
| Balões T75 Balões | Celltreat | 229340 | |
| Balões T182 | Celltreat | 229350 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| RPMI 1640 com L-glutamina | Corning | 10-040-CV | |
| DMEM com L-glutamina e 4,5 g/L de glicose | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Bovino (FBS) | Atlas Biologicals | FP-0500-A | |
| Tragacanto em pó | MP Bio | MP 104792 | |
| Crystal Violet | Amresco | 0528-1006 | |
| Etanol desnaturado | VWR International | BDH1156-1LP | |
| Placa | de 6 poçosCelltreat | 229106 | |
| placa de 12 poços | Celltreat | 229111 | |
| Sequenciamento Oligos | IDT consulte a | tabela 1 | |
| Qubit 3.0 | ThermoFisher | Qubit 3.0 | outros métodos são aceitáveis. |
| Kit de ensaio Qubit dsDNA BR | ThermoFisher | Q32850 | outros métodos são aceitáveis. |
| Kit de ensaio Qubit RNA HS | ThermoFisher | Q32852 | outros métodos são aceitáveis. |
| Gabinete de Biossegurança Classe II | Varia | N/A | Isso é necessário para o trabalho com vírus vivos. |
Referências
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675C-686C (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guill....
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Reimpressões e permissões
