光干渉断層計: マウス網膜神経節細胞In Vivoイメージング
Summary
本稿では、高分解能のスペクトル領域光干渉断層法 (SD OCT) とマウス網膜の生体内イメージングのためのプロトコルについて説明します。それは網膜神経節細胞 (RGC) のいくつかのスキャンと説明方法を定量化、視神経乳頭周囲地域に焦点を当てください。
Abstract
網膜の構造変化は、眼疾患の一般的な症状です。光干渉断層計 (OCT)、識別可能生体内で-迅速、繰り返し、かつ高解像度で。このプロトコルでは、視神経症 (OPN) を研究するための強力なツールとしてマウス網膜における OCT イメージングについて説明します。OCT システムは共通の事後の組織学的アッセイに干渉法に基づく、非侵襲的代替です。それは網膜の間引きや肥厚などの変更を追跡する可能性を許可する網膜の厚さの迅速かつ正確な評価を提供します。Opa1delTTAGマウス線の例と画像の処理と解析を提案します。スキャンの 3 種類が提案されている、2 つの定量方法: 標準的な自家製のキャリパー。ラジアル スキャン中に視神経乳頭周囲網膜の上の使用に最適、後者は薄い構造の分析により正確であること、お勧めします。ここで説明したすべてのアプローチの網膜神経節細胞 (RGC) のデザインしますが、他の細胞集団に容易に適応可能であります。結論として、10 月マウス モデル表現型では効率よく、治療の信頼性評価に使用する可能性があります。
Introduction
OCT は、網膜構造1、視神経乳頭視神経などの検討を容易にする診断ツールです。長年にわたって齧歯動物4、5人間2,3病気の進行の信頼性の高い指標になりました。2 μ m の軸解像度の網膜の層の断面像を作成するのに干渉計を使用します。最も内側の層は、網膜神経線維層 (視神経) RGC 軸索を含む主 RGC 体を含む神経節細胞層 (GCL) が続いています。次に、RGC 樹状突起がバイポーラ、水平、およびアマクリン細胞の軸索を満たす内部網状層 (IPL) です。水平細胞と共に、これらは内部の核層 (INL) を形成し、その突起を結ぶ外網状層 (OPL) における視細胞軸索。これは光受容体細胞体による外核層 (ONL) が続き、内部セグメント/外側セグメントとも呼ばれる外境界膜 (OLM)、視細胞層から分離されている (は/OS) 層。最後に、マウス網膜における最後の観察可能な層が網膜色素上皮 (RPE)、脈絡膜 (C)。単独での視神経が薄すぎてマウスを用いての測定通常このように、視神経/GCL の分析代わりには望ましい4,5です。別の可能性は IPL に加えて後者を含む GC の複雑なレイヤー、やすく厚くそしてこうしても 10 月を測定する4をスキャンします。その結果、10 月は OPNs のように網膜の病理組織学的の状態に洞察力を提供できます。
また、マウス網膜の厚さはしばしば事後組織学と分析されます。ただし、組織の採取、固定、切断、染色、取付、等したがって、微妙な厚みの変化など、いくつかの欠陥に関するこのテクニック面の制限を検出できません。最後に、同じマウスはいくつかの時間にテストできませんのでポイントごとのペット数 OCT 用とは異なり大幅増加を研究します。すべてのすべてで、繰り返し非侵襲、高解像度、可能性、時間監視時間と OCT 技術の使いやすさで、選択の方法網膜疾患研究です。
マウス モデルは、遺伝子欠陥を識別するために、retinopathies6の分子機構を解明するために使用されます。OPN は、約 120 万 RGC 軸索から成っている、(に)、視神経に重大な障害と網膜症のフォームです。OPN は ON に集中することができます。 または他の疾患、先天性またはない7、二次視野欠損しその後、失明をリードすることができます。OPN の特性 RGC 損失、被害、見られるよう人間 OCT で視神経と GCL2,3を薄くなります。一方、OPN の病態はまだよく理解されていない、それゆえマウス網膜をテストする必要性のまま。
本稿では、イメージングと定量 Opa1delTTAGマウス線8、の9、支配的な視神経萎縮 (DOA)10のモデル例を用いた網膜層厚さをについて説明します。RGC の病態を評価するために、長方形、放射状、環状のスキャンは定量化されました。これは、10 月のソフトウェアによって提供される標準ノギスまたはオープン ソース画像処理プログラムの開発した自家製マクロで行われました。標準ノギスは、自家製キャリパーが使いやすい、再現、およびより正確なと操作が難しく、視神経/GCL より頻繁に厚い。マクロは、自動的に検出された層の 5 点と視神経乳頭地域の両側の固定位置の測定を実行します。提案するプロトコルの目的は、Rgc 焦点を網膜の位置を指定するのに OCT スキャン データ収集を記述するためです。
Protocol
Representative Results
Discussion
非侵襲的体内イメージング法、OCT システムは、高解像度の網膜クロス section のようなスキャンを提供します。したがって、その主な利点は、その潜在的な日常的にマウスのモデルに人間に適用されるプロトコルを転置する素晴らしい機会の詳細な分析です。
Opa1delTTAG変異マウスの例、SD 10 月結果 DOA 病態9のさらなる探鉱の視神経、…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事に支えられた連合国デ Aveugles 網膜フランス、モンペリエ大学 Inserm et Déficients Visuels (UNADEV)、協会症候群・ デ ・ ウルフラム、財団を注ぐラ凝った Médicale 財団・ ド ・ フランスと卓越性の研究室EpiGenMed プログラム。
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Referências
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