Оптическая когерентная томография: Визуализация мыши сетчатки ганглия клетки в естественных условиях
Summary
Эта рукопись описывает протокол для изображений в vivo сетчатки мышь с разрешением спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Октябрь). Она фокусируется на клетки сетчатки ганглии (РЦ) в околососковой области с несколькими сканирование и количественного подходов, описанных.
Abstract
Структурные изменения в сетчатке являются распространенными проявлениями офтальмологических заболеваний. Оптическая когерентная томография (Окт) позволяет их идентификации в естественных условиях— быстро, многократно и с высоким разрешением. Этот протокол описывает OCT изображения на сетчатке мыши как мощный инструмент для изучения оптической невропатии (OPN). Окт система является альтернативой общей посмертное гистологических анализов, на основе интерферометрии, неинвазивная. Она обеспечивает быстрые и точные оценки толщины сетчатки, позволяя возможность отслеживать изменения, такие как истончение сетчатки или утолщение. Мы представляем визуализации процесса и анализ на примере линии мышиdelTTAG Opa1. Предлагаются три типа сканирования, с двумя методами количественной оценки: стандартные и домашние суппортов. Последний лучше всего подходит для использования на сетчатке околососковой во время радиальных сканирования; будучи более точной, является предпочтительным для анализа тоньше структур. Все описанные здесь подходы предназначены для клеток сетчатки ганглии (РЦ), но легко адаптируется для других клеточных популяций. В заключение Окт эффективен в мыши модель фенотипа и имеет потенциал, чтобы быть использованы для надежной оценки терапевтических вмешательств.
Introduction
OCT-это диагностический инструмент, который облегчает изучение сетчатки структуры1, включая головку зрительного нерва (БЕЙКЕ). С годами он стал надежным показателем прогрессирования заболевания людей2,3, а также в грызунов4,5. Он использует интерферометрии для создания поперечных изображения слоев сетчатки осевой с разрешением 2 мкм. Внутренний слой является сетчатки слой нервных волокон (RNFL), содержащий RGC аксонов, который сопровождается слоя клеток ганглия (GCL), содержащие главным образом RGC органов. Далее идет внутренний сплетениевидный слой (IPL), где RGC дендритов встречаются биполярный, горизонтальные и Амакриновые аксоны ячейки. Это, вместе с горизонтальной клетки, формируют внутренний ядерный слой (INL), и их выступов соединиться с фоторецепторных аксоны в внешний сплетениевидный слой (ОБН). Это сопровождается ядерной слоя (ONL), с органами фоторецепторных клеток и отделена от фоторецепторных слоя внешней ограничивающим мембраны (OLM), также называемый внутренний сегмент/наружный сегмент (IS / OS) слоя. Наконец последний наблюдаемых слои в сетчатке мыши являются пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) и сосудистое (C). Только RNFL обычно слишком тонким, чтобы быть измерена в мышей; Таким образом вместо анализа RNFL GCL — предпочтительно4,5. Другой возможностью является GC комплекс слой, который содержит последний дополнение к IPL, облегчая толще и таким образом даже для измерения на Окт сканирует4. Следовательно OCT может обеспечить понимание патологическое состояние сетчатки, такие как в OPNs.
Кроме того толщина сетчатки мыши часто анализируется с посмертной гистологии. Однако этот метод лица ограничения, касающиеся ткани коллекции, фиксации, резки, окрашивание, монтаж, и т.д. следовательно, некоторые дефекты, такие как толщина тонкие изменения, не может быть обнаружена. Наконец, поскольку и та же мышь не может быть протестирован в несколько раз указывает, количество животных каждого исследования значительно увеличивается, в отличие от для октября. Все в всех не инвазивность, с высоким разрешением, возможности для повторения, время мониторинга во времени и простота использования технологии OCT делают его методом выбора в исследования заболеваний сетчатки.
Мыши модели используются для выявления дефектов гена и прояснения молекулярных механизмов лежащие в основе ретинопатии6. OPN — это форма ретинопатии с существенный ущерб зрительного нерва (на), которая состоит из примерно 1,2 миллиона RGC аксоны. OPN может быть направлена на ON или может быть вторичным на другие заболевания, врожденные или не7, приводит к потере зрительного поля и позднее, слепота. Характерные черты OPN являются RGC потери и об ущербе, который может наблюдаться в человека OCT RNFL и GCL истончение2,3. Тем временем патофизиологии OPN еще плохо поняты, и поэтому остается необходимость тестирования мыши сетчатки.
Эта рукопись описывает изображений и количественной оценки толщины слоя сетчатки, используя пример Opa1delTTAG мыши линии8,9, модель доминирующим атрофия зрительного нерва (DOA)10. Чтобы оценить RGC патофизиологии, радиальные, прямоугольные и кольцевой проверки были количественно. Это было сделано с стандартных суппортов, предоставляемый OCT программного обеспечения или с домашним макрос, разработанные для обработки изображений открытым исходным кодом программы. Стандартные калибры трудно манипулировать и часто толще, чем RNFL/GCL, в то время как домашние суппорта проста в использовании, воспроизводимые и более точным. Макрос выполняет измерения автоматически обнаруженных слоя, в 5 пунктах и на стационарных позициях, на обеих сторонах БЕЙКЕ в околососковой области. Цель представленных протокола является описание OCT сканирования приобретение для указания сетчатки позиционирования, с акцентом на РГК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Системе OCT, неинвазивная в vivo imaging метод, обеспечивает высоким разрешением сканирования сетчатки кросс-секторальная-как. Таким образом ее главным преимуществом является ее потенциал для детального анализа, прекрасная возможность транспонировать протоколы обычно применяется для …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Inserm, университет Монпелье, Франция сетчатки, Союза национальных des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Ассоциация синдром де Wolfram, Фонд налить la Recherche сообщала, Фондасьон де Франс и лаборатории передового опыта EpiGenMed программа.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
Referências
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., Pagon, R. A., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. 7 (2007), (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
